摘要
目的: 运用网络药理学的研究方法，分析清肺通络方治疗儿童MPP的作用机制;进一步通过观察清肺通络方对MP诱导的MPP小鼠模型体内RAGE与NLRP3炎症小体的调控作用，证实清肺通络方临床疗效机制及作用靶点;最后结合临床研究探讨儿童MPP与RAGE、NLRP3变化之间的相关性及清肺通络方对其的干预作用，为中医药治疗MPP提供坚实的科学依据。 方法: 1.利用相关数据库检索结合手动文献检索分别筛选出清肺通络方有效活性成分靶点及儿童MPP疾病的相关靶点，分别对药物与疾病靶点进行蛋白互作网络进行构建，并提取交集网络以获得清肺通络方治疗儿童MPP的交集靶点，进而对交集靶点在线上数据库进行富集分析，最终获取清肺通络方治疗儿童MPP的核心靶点。 2.将60只BALB/c小鼠随机分为6组（A正常组、B模型组、C清肺通络方组、D阿奇霉素组、E中西医结合组、FRAGE抑制剂组），每组10只。A组以50ul无菌盐水滴鼻（日2次），其余各组均以50ulMP菌液滴鼻（日2次），连续6天。感染第2天开始治疗。治疗第10天、第20天每组每次各处死小鼠5只。采集血清及肺组织，HE染色观察肺组织病理;ELISA法检测血清中RAGE、NLRP3含量;PCR法检测肺组织MP-DNA、RAGEmRNA、NLRP3mRNA表达;WesternBlot法检测肺组织RAGE、NLRP3蛋白的表达。 3.选取上海中医药大学附属龙华医院儿科和河南中医药大学第一附属医院儿科在2021年10月01日至2023年02月28日期间收治的MPP（风热闭肺证）住院患儿62例，随机分为治疗组、对照组，每组31例。治疗组予阿奇霉素单程治疗+清肺通络方口服，对照组予阿奇霉素序贯治疗法，疗程20天。治疗结束后比较两组临床疗效。治疗前后留取入组患儿外周静脉血5ml，PCR法检测外周血单核细胞中RAGEmRNA、NLRP3mRNA表达;WesternBlot法检测外周血单核细胞中RAGE、NLRP3蛋白的表达。 结果: 1.网络药理学研究:清肺通络方发挥治疗作用主要成分可能是槲皮素、β-谷固醇、山奈酚、常春藤皂苷元、豆甾醇、异鼠李素、丁子香萜等。筛选出MAPK1、MAPK10、MAPK14、CASP3、IL-6、TNF、RAGE、CXCL8、EGFR、JUN、MYC、PTGS1、STAT3等核心靶点。富集关键通路有癌症途径相关信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、丙型/乙型肝炎相关信号通路、HIF-1信号通路、松弛素信号通路、T细胞受体信号通路、NF-kB信号通路等，涉及免疫调节、细胞凋亡、抗氧化应激、抑制炎症反应等多个方面，从而达到治疗儿童MPP的作用。 2.动物实验研究:HE病理显示A组小鼠肺组织形态结构正常;B组小鼠肺泡壁结构被破坏，可见大量炎症细胞渗出至小叶间间隔，出现肺间质水肿，支气管官腔变窄明显;药物干预后，C组、D组、E组、F组小鼠肺组织病理损伤均有不同程度改善，其中以E组、F组小鼠肺组织病理损伤改善最佳。MP-DNA结果显示A组小鼠肺组织MP-DNA含量为0;疗程结束后与B组对比，C组、D组、E组、F组MP-DNA含量下降(P＜0.05)。ELISA、PCR及WesternBlot结果显示B组小鼠血清及肺组织中RAGE、NLRP3表达量最高，药物干预后，C组、D组、E组、F组血清及肺组织中RAGE、.NLRP3表达量下降(P＜0.05)，其中以E组、F组下降最为明显，E组与F组血清中RAGE、NLRP3含量及肺组织RAGE、NLRP3蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05);与E组对比，F组小鼠肺组织RAGEmRNA表达量最低(P＜0.05)，NLRP3mRNA表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。 3.临床试验研究:治疗前两组在性别、年龄、发病时间上无统计学差异，基线可比(P＞0.05);治疗前两组在WBC、CRP、LDH、RAGE、NLRP3等指标上无统计学差异(P＞0.05)。疗程结束后治疗组疾病疗效及中医证候疗效的的总体平均水平上优于与对照组(P＜0.05);治疗组临床疗效总有效率93.5％,对照组临床疗效总有效率87.1％,在临床疗效总有效率方面治疗组与对照组差异无统计意义(P＞0.05);治疗组临床疗效治愈率54.8％,优于对照组临床疗效治愈率29.0％(P＜0.05);治疗组临床疗效显效率83.9％,优于对照组临床疗效显效率61.3％(P＜0.05);两组患儿中医证候疗效总有效率93.5％,对照组中医症候疗效总有效率83.9％,两组别在中医证候疗效总有效率差异无统计意义(P＞0.05);治疗组中医证候疗效治愈率54.8％,优于对照组中医证候疗效治愈率25.8％(P＜0.05),治疗组中医证候疗效显效率87.1％,优于对照组中医证候疗效显效率54.8％(P＜0.05)。在主要症状起效时间上治疗组优于对照组(P＜0.05),即治疗组在改善发热、咳嗽、痰壅及气喘方面的起效时间优于对照组（P＜0.05）;在改善肺部体征方面治疗组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后治疗组与对照组在降低WBC、CRP方面差异无统计学意义（P＞0.05），治疗组在降低LDH方面优于对照组（P＜0.05）。治疗组在降低RAGE与NLRP3mRNA及蛋白水平上优于对照组（P＜0.05）。 结论: 1.清肺通络方治疗儿童MPP的作用机制涉及多组分、多靶点、多通路，主要是通过免疫调节、抗氧化应激、抑制炎症反应等方面来发挥治疗作用。 2.MPP小鼠模型血清及肺组织中均存在着RAGE与NLRP3高表达，说明MPP小鼠体内存在免疫异常。清肺通络方可能通过下调RAGE表达，抑制NLRP3炎症小体活化，参与免疫调控，从而减轻MP感染所致的肺损伤，发挥治疗作用。 3.临床研究表明治疗组在临床疗效总体平均水平及起效时间上优于与对照组，能减少抗生素的使用，并能够有效的降低RAGE与NLRP3的水平，调节MPP儿童的固有免疫功能，进而有效的改善患儿的临床症状。
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