摘要
目的:随着人类预期寿命延长，衰老及衰老性疾病被更广泛关注，干细胞已被广泛研究用于临床治疗，本课题观察“补肾填精”经典方剂左归丸中有效成分对衰老骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）的影响，并基于AGEs-RAGE轴进一步探讨左归丸有效成分延缓BMSCs衰老的作用机制。 方法:大鼠BMSCs原代培养，传代至第3～第5代用于实验研究，并对得到的细胞进行表面抗原鉴定及多向分化潜能的鉴定，以确定分离培养得到的是BMSCs;通过MTT重复实验观察左归丸中有效成分莫诺苷、马钱苷、山奈酚和杯苋甾酮对BMSCs增殖影响，并进一步确定最佳用药时间及用药浓度;D-半乳糖（D-gal）进行衰老造模，采用β-半乳糖苷酶染色确定最佳造模浓度;将实验分为空白对照组、D-gal衰老造模组以及D-gal+莫诺苷组、D-gal+马钱苷组、D-gal+山奈酚组和D-gal+杯苋甾酮组，48h后进行β-半乳糖苷酶染色，观察前述4种有效成分在最佳作用时间和浓度下对衰老BMSCs数目的影响，并选出相对更优成分作进一步研究;继续通过D-半乳糖造模，采用β-半乳糖苷酶染色的方法观察低浓度（最佳浓度÷5）、中浓度（最佳浓度）和高浓度（最佳浓度×5）优选成分对衰老BMSCs数目的影响;采用Real-time荧光定量PCR检测优选成分对BMSCs衰老相关分泌表型（senescence-associatedsecretoryphenotype,SASP）IL-6、HMGB1、GATA4、TRAF3IP2及衰老相关分子p53、p21、p16mRNA表达的影响;Westernblot法检测优选成分对衰老BMSCs衰老相关分子（p53、p21、p16）、RAGE、NF-κB、Glo1蛋白表达的影响;ELISA法检测各组细胞AGEs表达量及GLO1活性;活性氧检测试剂盒检测各组细胞活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）水平;AnneinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测各组细胞的凋亡情况。 结果: 1.莫诺苷、马钱苷、山奈酚和杯苋甾酮都能不同程度地促进BMSCs的增殖，其中4个有效成分作用于BMSCs的最佳时间是48h,最佳作用浓度分别是12.5μM、75μM、7.5μM、1.25μg/ml。 2.5g/L、10g/L、20g/L的D-半乳糖造模，与空白对照组比都能不同程度地增加β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数，其中10g/L的D-半乳糖造模组明显多于5g/L组，而与20g/L差别不大，故最终采用10g/L的D-半乳糖进行衰老造模。 3.莫诺苷、马钱苷、山奈酚和杯苋甾酮在相应最佳有效浓度和作用时间下，都能不同程度地减少β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数，其中中浓度马钱苷和山奈酚效果更为突出。 4.Real-time荧光定量PCR表明，与D-gal衰老造模组相比，马钱苷能减少衰老BMSCs中SASP（IL-6、HMGB1、GATA4、TRAF3IP2）（P＜0.05或P＜0.001）以及衰老相关分子p53、p21、p16的mRNA表达;与D-gal衰老造模组相比，山奈酚能够降低SASP中IL-6、HMGB1、TRAF3IP2的mRNA表达（P＜0.01或P＜0.001），GATA4表达反而升高。Westernblot结果表明，与D-gal衰老造模组相比，马钱苷和山奈酚都能减少衰老的BMSCs中衰老相关分子p53、p21、p16的蛋白表达，其中山奈酚能够显著降低p16的表达（P＜0.01）。 5.KEGG通路富集分析结果表明，左归丸延缓间充质干细胞衰老与175条信号通路密切相关（P＜0.05）,根据P值由小到大排名，其中AGEs-RAGE信号通路排名第1。 6.Westernblot结果表明，与D-gal衰老造模组相比，马钱苷和山奈酚都能减少衰老BMSCs中RAGE、NF-κB蛋白的表达（P＜0.05或P＜0.01），增加GLO1的表达（P＜0.01）。ELISA检测表明，与D-gal衰老造模组相比，马钱苷和山奈酚都能减少衰老BMSCs中AGEs的表达（P＜0.01或P＜0.001），增加GLO1活性（P＜0.001）。活性氧检测结果表明，与D-gal衰老造模组相比，马钱苷和山奈酚都能减少衰老BMSCs中ROS的水平。AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测结果表明，D-gal造模未显著促进BMSCs的细胞凋亡，与D-gal衰老造模组比，D-gal+马钱苷组和D-gal+山奈酚组细胞凋亡无显著变化。 结论: 1.左归丸有效成分莫诺苷、山奈酚、马钱苷、杯苋甾酮都有促进BMSCs增殖和减少衰老细胞的作用。 2.左归丸有效成分马钱苷和山奈酚能延缓BMSCs的衰老，减少SASP和衰老相关分子的表达。 3.马钱苷和山奈酚对AGEs-RAGE轴中相关分子和蛋白的调节可能是其发挥延缓BMSCs衰老的重要机制。
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