摘要
Polζ作为跨损伤DNA合成(TranslesionDNAsynthesis，TLS)途径中主要的延伸型DNA聚合酶，在DNA损伤耐受途径中都发挥了至关重要的作用。在人体细胞中，Polζ由REV3L、REV7、POLD2和POLD3四个亚基组成，其中REV3L为催化亚基，其与调节亚基REV7的互作构成了Polζ的核心，而POLD2和POLD3则是Polζ和复制型DNA聚合酶δ共有的辅助亚基。 实验室前期工作发现，REV3L在翻译后会发生依赖TASP1的蛋白切割，产生一个大小约70kDa的氨基端切割产物REV3L-N70和一个大于310kDa羧基端切割产物REV3L-C。我们同时发现UV照射会引起REV3L氨基端切割产物REV3L-N70发生ATR依赖的磷酸化修饰。REV3L-N70上存在9个S/TQ基序，为ATR激酶潜在修饰位点，470位丝氨酸是其中之一，且该位点序列在脊椎动物中高度保守。为探索S470A位点磷酸化修饰可能的生物学意义，我们利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，获得470位丝氨酸发生丙氨酸替代突变的细胞系HCT116-R-REV3L-S470A。利用这个细胞系，我们探索了REV3L-S470A突变蛋白在细胞缓解紫外和顺铂等理化因素引起的复制压力及DNA损伤中的功能。结果显示，REV3L蛋白第470位残基发生丙氨酸替代突变能严重干扰细胞耐受顺铂和紫外诱导的DNA损伤的能力，提示损伤压力下470位丝氨酸上发生的磷酸化修饰事件在REV3L活化过程中发挥了重要作用。 实验室前期曾发现，伴随REV3L诱导表达，细胞内Polζ调节亚基REV7稳定态蛋白水平会随之上升。TRIP13是一种ATPase,而P31comet则是TRIP13和它底物间的连接蛋白，两者共同作用能推动REV7发生ATP依赖的构象变化，从而使REV7与其结合蛋白分离。由此，我们产生一个猜想，TRIP13与P31comet是否能通过调节REV7构象影响其与REV3L的互作，进而影响REV7稳定性。在本工作中我们就TRIP13与P31comet对REV7蛋白稳定性可能有的影响进行了初步探索。我们使用多个靶向TRIP13和P31comet的shRNA克隆，敲低对应的目的基因表达，通过蛋白免疫印迹实验检测目标蛋白下降情况以及REV7蛋白量的变化。初步实验结果显示，靶向TRIP13与P31cometmRNA的shRNAs,在敲低目标基因表达的同时都能显著提升细胞内稳定态REV7蛋白量。但在目前实验条件下，过表达外源TRIP13和P31comet蛋白并未明显降低表达了TRIP13与P31cometshRNA的细胞中稳定态REV7蛋白量。因此，TRIP13与P31comet参与调控REV7稳定性的设想仍需后续实验进一步验证。
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