摘要
蜱虫是节肢动物中仅次于蚊子的第二大常见病原体载体，目前，我国已报道约120种蜱虫，其中有60多种可以传播病原体。蜱虫叮咬可将多种致病病毒传播给脊椎动物，对人类和动物的生命安全造成严重危害。值得人们注意的蜱传病毒包括蜱传脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病病毒、非洲猪瘟病毒和大别班达病毒等。近年来不断有新型蜱传病毒被发现，且蜱传疾病病例数呈逐年上升趋势。中国幅员辽阔，从北到南纬度跨越近50度，有6个气候带，每个气候带上蜱虫和蜱传病毒的种类不尽相同。山东省是中国东部沿海的一个重要省份，与朝鲜半岛、日本列岛隔海相望。青岛地处北温带季风区，属于海洋性气候。青岛地区生物资源丰富，东南濒临黄海，是我国重要的出海口之一。青岛地理环境为蜱虫提供了适宜的栖息地，也为蜱传病原体的传播提供了便利条件。为了解青岛地区蜱传病毒的本底情况，本研究建立并优化蜱虫测序前处理方案，提高宏基因组技术对蜱传病毒的检出率和病毒丰度，并在此基础上深入探究山东省青岛市野生刺猬和野兔携带的蜱传病毒组成，利用病毒宏基因组学和生物信息学技术对蜱虫病毒群落及病毒序列的遗传特征进行分析，挖掘蜱虫病毒组内具有潜在致病性的新型病毒，构建当地蜱传病毒资源库，为预测和防控蜱传疾病暴发提供理论依据。 具体的研究结果如下: 1.本研究于2019年在山东省青岛市野生刺猬和野兔身上采集蜱虫662只，2020年7月，在山东省青岛市郊区采集354只游离蜱虫幼虫。通过形态学鉴定和线粒体16S核糖体RNA测序对蜱虫种类进行鉴定。2019年野生刺猬身上收集的蜱虫种类分别为褐黄血蜱（n=155）、血红扇头蜱（n=62）、中华革蜱（n=67）、长角血蜱（n=77）和铃头血蜱（n=59）。2019年野兔身上收集的蜱虫种类为中华革蜱（n=242）。2020年收集的游离蜱虫种类为褐黄血蜱（n=354）。 2.通过生物信息学分析，比较Trizol法提取蜱虫匀浆RNA（直接法）和经优化处理的病毒总核酸（优化法）高通量测序的结果差异。优化法的测序结果中宿主reads和核糖体RNAreads之和占比下降，检出的病毒reads数量增多（p=0.0159）,病毒contigs占总contigs的百分比升高（p=0.0159）。利用湖北蜱虫布尼亚病毒评估不同测序前处理方案的测序后病毒组装覆盖深度，发现优化法的测序组装完整且稳定，测序深度为直接法的1-4倍。Alpha多样性分析结果显示经优化法处理后进行高通量测序检出的病毒物种丰度和多样性增加。 3.本研究构建的蜱虫病毒文库种类主要来自14个病毒科的37种病毒，包括楚病毒科、小核糖核酸病毒科、奈罗病毒科、白蛉纤细病毒科、黄病毒科以及传染性软化症病毒科等常见的蜱媒病毒科。在种水平检出湖北蜱虫病毒、湖北蜱虫样病毒51、奥多摩町病毒、大别班达病毒、黄陂蜱虫病毒1和河南蜱虫病毒等节肢动物相关病毒。 4.对2019年收集的来自刺猬和野兔的蜱虫病毒组进行病毒宏基因组测序分析，共鉴定出10种具有完整CDS的RNA病毒，分属于4个病毒科，共计36株。其中7种为已知病毒，分别是传染性软化症病毒科的褐黄血蜱软化症病毒和湖北蜱虫病毒1;白蛉纤细病毒科的大别班达病毒和奥多摩町病毒;奈罗病毒科的黄陂蜱虫病毒1和河南蜱虫病毒;楚病毒科的昌平蜱虫病毒3,其中褐黄血蜱软化症病毒和奥多摩町病毒为中国首次发现。 5.根据与已知病毒核苷酸序列一致性小于80％的病毒定义为新发现的病毒，共发现3种新病毒。分别为传染性软化症病毒科的青岛蜱虫软化症病毒、白蛉纤细病毒科的青岛蜱虫白蛉病毒和青岛蜱虫尤库病毒。青岛蜱虫软化症病毒与已知的褐黄血蜱软化症病毒核苷酸序列一致性为66.6％。青岛蜱虫白蛉病毒L、M和S片段与已知的武川病毒核苷酸序列一致性分别为75.8％,68.3％和67.6％。青岛蜱虫尤库病毒的L、M和S片段与已知的东京病毒核苷酸序列一致性分别为77.1％，71.5％和45.8％。 6.本研究发现的两种已知病毒:褐黄血蜱软化症病毒和奥多摩町病毒，以及三种新型病毒:青岛蜱虫软化症病毒、青岛蜱虫白蛉病毒和青岛蜱虫尤库病毒与首次在日本检出的病毒在系统进化树中聚集在一个分支上。在青岛地区蜱虫中检出的10种病毒中，5种22株（61.1％）与日本株系有亲缘关系。由于青岛与日本隔海相望，推测中国和日本的一些病毒可能拥有共同祖先，病毒随着宿主经由候鸟或者商业活动跨海传播。随后在漫长的进化过程中，不同地区的病毒为了适应当地环境和宿主发生了不同的进化。 蜱传病毒已经引起越来越多的全球公共卫生关注。对病毒核酸提取方法进行优化是提高宏基因组对蜱虫病毒群落检出丰度的重要步骤，本研究设计的核酸提取方法提高了病毒reads的数量、病毒contigs百分比、基因组组装覆盖率以及物种多样性。通过此方法在青岛地区的蜱虫中检出10种36株病毒，发现3种新型病毒，进一步揭示该地区蜱传病毒的多样性，阐明了发现病毒的系统进化历程，为研究中国华东地区蜱传病毒的本底情况提供了基础数据。研究结果为中日两国之间可能存在蜱媒病毒的跨海传播提供了理论依据，有助于追踪病毒进化历程，防控新发病毒流行以及预防病毒性疾病扩散，表明了对蜱媒病毒监测的必要性和重要性。
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