摘要
目的:探讨在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤模型中，miR-21-5p与溶质运载蛋白16A家族成员10(solutecarrierfamily16Amember10,SLC16A10)的表达变化规律，以及二者的靶向调控对急性肺损伤(Acutelunginjury,ALI)的治疗作用。 方法:(1)构建LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤模型，用10ug/ml的LPS直接刺激A549细胞，加入与LPS等量的磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffer，PBS)作为对照，设置不同时间点收集细胞，提取RNA和蛋白，采用实时荧光定量(Realtimequantitativepcr,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Westernblot，WB)法检测各组细胞白细胞介素-1(Interleukin1beta，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor,TNF-α)表达量。(2)采用RT-qPCR法检测LPS刺激后各时间点细胞中miR-21-5p的表达量。(3)通过转染miR-21-5pmimic，上调A549细胞中miR-21-5p表达，并用RT-qPCR和WB法检测各组细胞中IL-1β、TNF-α的表达量。(4)利用miRDB、TargetScan、miRWalk、Starbase、Tarbase、miRTarbase数据库预测miR-21-5p靶基因并取交集，定为靶基因交集组;利用DisGeNet数据库搜索脓毒症(sepsis)相关基因组，定为脓毒症基因组;将两组取交集定为核心基因组，并通过查阅相关文献确定SLC16A10作为研究靶点。将SLC16A10-WT和miR-21-5pmimic共转染293T细胞48h后，采用双荧光素酶报告法检测双荧光素酶活性，明确二者之间的调控关系;A549细胞转染miR-21-5pmimic和miR-21-5pinhibitor后，采用RT-qPCR和WB法检测SLC16A10的表达量，明确调控miR-21-5p对SLC16A10表达的影响。(5)通过转染siRNA抑制A549细胞中SLC16A10表达，加入LPS刺激后，利用qPCR和WB法检测A549细胞中IL-1β、TNF-α的表达量，明确抑制SLC16A10表达对LPS诱导的炎症损伤的作用。(6)A549细胞单独转染miR-21-5pinhibitor或同时转染miR-21-5pinhibitor和si-SLC16A10,比较单独抑制miR-21-5p表达和同时抑制miR-21-5p与SLC16A10表达后，IL-1β、TNF-α的表达量的变化，明确miR-21-5p靶向SLC16A10在LPS诱导的A549细胞炎症损伤中的作用。 结果:(1)LPS(10ug/ml)刺激A549细胞后IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白于6、12、24h表达量相对于对照组均明显增加(P＜0.05)，且mRNA达到峰值的时间为6h，而蛋白水平呈明显的时间依赖性，于24h相对表达较高。(2)与对照组比较，LPS刺激后A549细胞中miR-21-5p表达明显升高(P＜0.05),但未出现明显的时间相关性。(3)转染miR-21-5pmimic可上调miR-21-5p在A549细胞内的表达，与对照组比较，LPS刺激后，转染miR-21-5pmimic的细胞中IL-1β、TNF-α的表达量明显减少(P＜0.05)，提示miR-21-5p对LPS诱导的炎症损伤具有保护作用。(4)经miRDB、TargetScan、miRWalk、Starbase、Tarbase、miRTarbase预测miR-21-5p的靶基因，取交集定为靶基因交集组，包含51个基因;经DisGeNet数据库检索的脓毒症相关基因，定为脓毒症基因组，包含1448个基因;两组取交集定为核心基因组，包括SLC16A10、TNPO1、STAT3、PIK3R1和FASLG5个基因，依据miRNA与靶基因间作用关系，并通过查阅相关文献排除核心基因组内TNP01、FASLG、STAT3、PIK3R1四个已被验证过与miR-21-5p具有靶向关系的基因后，选定SLC16A10作为候选基因进行后续实验研究。双荧光素酶结果显示:与SLC16A10-WT和NCmimic共转染相比，SLC16A10-WT和miR-21-5pmimic共转染的细胞，荧光素酶活性明显受到抑制(P＜0.05);相反，SLC16A10-MUT和miR-21-5pmimic共转染的细胞显示出基本不变的荧光素酶活性(P＞0.05)。转染miR-21-5pmimic下调SLC16A10的表达，转染miR-21-5pinhibitor上调SLC16A10表达(P＜0.05)，提示SLC16A10是miR-21-5p的靶基因。(5)转染si-SLC16A10可下调A549细胞内的SLC16A10的mRNA和蛋白水平，转染si-SLC16A10与转染NCsiRNA的A549细胞相比，经相同剂量LPS处理后，前者IL-1β、TNF-α的表达量明显降低(P＜0.05)，提示抑制SLC16A10表达可减轻LPS诱导的炎症损伤。(6)与转染NCinhibitor的A549细胞相比，转染miR-21-5pinhibitor的A549细胞，经相同剂量LPS处理后，诱导产生的IL-1β、TNF-α的表达量明显增加(P＜0.05);与仅转染miR-21-5pinhibitor，造成的炎症因子显著升高相比，同时转染miR-21-5pinhibitor和si-SLC16A10,可以显著减少IL-1β、TNF-α表达(P＜0.05),提示miR-21-5p通过调控SLC16A10表达发挥对LPS诱导的炎症损伤的保护作用。 结论:(1)miR-21-5p参与了LPS诱导的A549细胞急性炎症损伤过程，并在其中发挥保护作用。(2)miR-21-5p通过靶向SLC16A10,减轻LPS诱导A549细胞的炎症反应。(3)SLC16A10可能是急性肺损伤治疗的潜在靶点。
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