摘要
天麻是兰科植物天麻（GastrodiaelataBl.）的干燥块茎，具有镇静催眠、神经保护和认知功能改善等多种药理活性，是一种药食两用的名贵中药材。目前市场上主要流通的是乌天麻（GastrodiaelataBl.f.glaucaS.Chow）、红天麻（GastrodiaelataBl.f.elata）和乌红天麻。其中，乌天麻产量低，价格高;其变型红天麻则产量高，而价格低一倍;乌红天麻为前两者的杂交品种。三种天麻的价格差异是否有其科学依据仍缺乏研究。已有报道采用聚合酶链反应可以区分三者，但其专属的质量控制方法和质量标准仍缺乏，现有研究无法区分不同产地的红天麻和乌天麻，使得天麻市场监管难以规范。因此为了更好地规范中药天麻市场，本课题对三种天麻开展化学物质差异研究，为寻找三种天麻的质量标志物并制订合理质量标准提供研究基础。 为了寻找乌天麻、红天麻和乌红天麻的化学质量标志物，本课题采用拟靶向代谢组学分析以更准确、可靠地寻找差异性成分，并进一步地通过基于解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）的空间代谢组学分析进行差异成分的原位可视化，共同为三种天麻的质量标志物研究提供依据。首先，本课题基于液质联用技术首次建立了天麻中534个成分的拟靶向分析方法，并发现14个潜在的差异成分可用于三种天麻的区分。研究首先采用超高效液相色谱串联线性离子阱静电场轨道高分辨质谱联用技术（UHPLC-LTQ/Orbitrap-HRMS）从三种天麻的非靶向代谢组学数据中筛选得到534个离子对。然后采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UHPLC-QQQ-MS）的动态多反应离子监测技术（dMRM）实现上述534个离子对的转移和监测。方法学验证结果表明，在1/103-1的浓度差异下，近75％的离子对线性相关性系数（R2）达到0.95,近90％的离子对强度的日内和日间重复性的相对标准偏差（RSD）达到30％以下，表明该方法具有良好的重复性、线性和稳定性。进一步通过对40批次不同产地天麻的检测分析（其中乌天麻14批，红天麻14批，乌红天麻12批），结合正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析，共发现88个差异离子对。初步鉴定了其中57个化合物，主要为巴利森苷类、有机酸和核苷及其衍生物。研究发现其中14个化合物可用于乌天麻、红天麻和乌红天麻的同时区分，它们是:m/z107.0488Da（4-Hydroxybenzylalcoholisomer）,m/z107.0525Da，m/z251.0768Da（Erythro-galacto-Nonulose）,m/z294.0832Da（Guano-Glc）,m/z318.1699Da，m/z348.0699Da（AMP/Deoxy-GMP）,m/z359.0977Da（Glucosyringicacid）,m/z391.1391Da（4"-hydroxybenzyl-gastrodin/Gastrodioside）,m/z520.1744Da[（-）-γ-L-[N-（4-hydroxybenzyl）]glutamyl-L-[S-（4-hydroxybenzyl）]cysteinylglycine/S-（p-HA-HA）-glutathione]，m/z535.1801Da（Resveratrol-diglucoside），m/z727.2085Da（ParishinB）,m/z802.3276Da,m/z1101.3434Da（ParishinR/S）,m/z1455.4243Da（ParishinC）。 其次，本课题基于解吸电喷雾电离串联四极杆飞行时间的高分辨质谱（DESI-Q-TOF-HRMS）首次对新鲜的乌天麻、红天麻和乌红天麻进行空间代谢组学研究。研究首先克服了鲜天麻含水量高、淀粉性强的难题建立了新鲜天麻切片的制备方法。在方法优化的基础上，对三种新鲜天麻组织切片进行了空间代谢组学分析，105个离子在天麻组织切片中具有特征空间分布，其中包括22个在皮层特征分布的离子，主要为有机酸类和寡肽类化合物;48个不规则特征分布的离子，主要为糖类、脂质和寡肽类化合物;35个在维管束特征分布的离子，主要为巴利森苷类和糖类化合物。对三种天麻的成像结果横向对比，发现了184个差异离子，其中67个可以将三种新鲜天麻区分。初步鉴定了120个差异成分，主要为巴利森类化合物、有机酸及其衍生物、寡肽和脂质。上述研究从空间维度首次展示了三种天麻中化学成分的空间分布差异，为了解质量标志物的空间分布特征提供了研究基础。 最后，本课题将拟靶向代谢组学和空间代谢组学研究结果结合，发现五个成分为共有差异成分。分别为:m/z459.1136Da（ParishinE/G）、m/z480.2229Da（Unknown21/22/23）、m/z503.1610Da（Trisaccharide）、m/z520.1744Da[（-）-γ-L-[N-（4-hydroxybenzyl）]glutamyl-L-[S-（4-hydroxybenzyl）]cysteinylglycine/S-（p-HA-HA）-glutathione]、m/z617.2301Da（CA（Arginine/GA/0））。其中，m/z459.1136Da在红天麻中的含量高于在乌红天麻中的含量;m/z480.2229Da在红天麻中的含量明显高于乌天麻;m/z503.1610Da在乌天麻中的含量明显高于在红天麻中的含量;m/z520.1744Da在三种天麻中的含量从高到低依次为乌天麻、红天麻、乌红天麻，是一个在拟靶向代谢组学和空间代谢组学研究中均被发现可以同时区分三种天麻的差异成分;m/z617.2301Da在乌天麻中的含量低于在红天麻或乌红天麻中的含量。以上差异成分中，m/z617.2301Da在三种天麻中具有维管束特征分布，其余四个差异成分在天麻中的空间分布特征为均匀分布。 综上所述，本论文建立了基于液质联用技术的拟靶向代谢组学分析方法和基于DESI-MSI的空间代谢组学分析方法，系统地对天麻不同变型及其杂交品种的质量标志成分进行了发现和表征，发现了可用于区分三种天麻的差异成分及其空间分布规律。本课题成功实现了不同产地乌天麻，红天麻和乌红天麻的差异成分发现和表征，具有更好的实用价值，为寻找三种天麻的质量标志物并制订合理质量标准奠定了坚实的基础。
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