摘要
肺癌在恶性肿瘤中的发病率和死亡率仍然占据主导地位。基于顺铂的化疗治疗作为肺癌的临床一线用药方案，对于延长肺癌患者的生存期尤为重要。然而，顺铂的获得性耐药性仍然是肺癌治疗结果欠佳的主要原因。因此，阐明顺铂耐药性背后的机制对于为肺癌提供新的有效治疗策略至关重要。细胞自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，自噬过程中，细胞保护性机制被激活，为癌细胞提供增加能量代谢所需的营养，并去除有毒的活性氧自由基和错误折叠的蛋白质，肿瘤细胞得以存活并最终导致耐药。高水平的自噬活性在顺铂耐药的肿瘤细胞中普遍存在，并被认为可以促进肿瘤细胞存活。越来越多的研究表明，阻断自噬可以有效增加肺癌细胞对顺铂的敏感性。 TRIP13(Thyroidhormonereceptorinteractor13)是AAA(+)ATP酶超家族成员之一，其参与一系列细胞过程，包括纺锤体组装检查点信号传导、DNA断裂修复和重组。研究发现，在膀胱癌中TRIP13过表达后，对抗癌药物，如顺铂和多柔比星的敏感性降低。关于TRIP13在肺癌中介导耐药的作用和机制尚不清楚，本研究拟研究TRIP13对于肺癌中顺铂耐药性的调控作用，探讨TRIP13在肺癌中调控顺铂敏感性的分子机制。 目的:1.探究TRIP13在肺癌中对顺铂敏感性的调控作用;2.探讨TRIP13对自噬的调控作用及其调控肺癌顺铂耐药的分子机制。 研究方法:使用TCGA数据库，分析TRIP13在肺癌中的表达情况;生存分析探究TRIP13与肺癌铂类药物治疗预后的关系。通过向A549细胞转染TRIP13和空载质粒，向A549/DDP细胞转染shTRIP13和对照质粒，上调或下调TRIP13的表达;WesternBlot检测自噬和凋亡相关蛋白表达情况;MTS法检测细胞在顺铂处理下的IC50;克隆形成实验检测细胞在顺铂处理下的增殖能力。 结果: 1.TRIP13在肺癌中表达上调，且与铂类药物的预后不良相关。 2.TRIP13能够调控肺癌细胞对于顺铂的药物敏感性:验证A549/DDP细胞系的耐药性，测定其耐药指数(RI)为5.4,耐药指数大于5,可以进行后续实验。对A549细胞进行TRIP13质粒转染，细胞中TRIP13蛋白表达量明显增加;同时A549细胞对于顺铂的药物敏感性相较于对照组明显降低。对A549/DDP细胞进行TRIP13敲低后，细胞中TRIP13蛋白表达量明显减少;同时细胞对于顺铂的药物敏感性相较于对照组明显升高。WB检测顺铂存在或不存在的情况下，在A549和A549/DDP细胞中分别过表达或敲减TRIP13后，凋亡相关蛋白水平的变化。结果显示，TRIP13可以有效抑制顺铂诱导的细胞耐药。 3.TRIP13促进肺癌细胞的自噬水平。WB结果显示，在A549细胞中过表达TRIP13后，LC3Ⅱ/Ⅰ水平上调、P62下调。在A549/DDP细胞干扰TRIP13后，LC3Ⅱ/Ⅰ水平下调、P62上调。A549细胞中过表达TRIP13后，与自噬晚期抑制剂CQ联合处理，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平进一步上调，说明自噬流通畅。 4.TRIP13通过自噬介导肺癌细胞对顺铂的耐药。MTS实验显示，与空载质粒对照组相比，转染TRIP13能够减少顺铂的药物毒性作用，而这种作用可以被自噬抑制剂CQ逆转。与空白对照组相比，敲低TRIP13能够增加顺铂的药物毒性作用，而这一作用能被自噬激活剂雷帕霉素逆转;克隆形成实验也显示了类似的结果。单独使用顺铂或与氯喹(CQ)联合处理对照组或过表达组的A549细胞，WesternBlot检测凋亡相关蛋白的变化，发现TRIP13过表达诱导的凋亡蛋白减少被CQ逆转。用shNC或shTRIP13质粒转染A549/DDP细胞，单独使用顺铂或与雷帕霉素联合处理后，结果显示雷帕霉素有效拮抗了TRIP13敲减引起的细胞凋亡增加。 结论: 1.TRIP13在肺癌细胞中抑制顺铂诱导的凋亡，介导肺癌细胞对顺铂的耐药性。 2.TRIP13在肺癌细胞中激活自噬。 3.TRIP13通过激活自噬通路增加肺癌细胞对顺铂的耐药性。
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