摘要
实验一探索不同浓度合欢安神方对PCPA失眠小鼠的影响，验证合欢安神方的生物安全 目的:采用腹腔注射对氯苯丙氨酸（p-Chlorophenylalanine,PCPA）构建失眠小鼠模型，通过行为学检测及相关蛋白表达量变化，探讨不同浓度合欢安神方对失眠小鼠的影响，并确立优效浓度。 方法:本研究通过PCPA法建立失眠动物模型，将60只SPF雄性小鼠随机分为对照组、模型组，连续4天腹腔注射PCPA造模成功后，模型组小鼠再随机分为模型组、合欢安神方低剂量组、合欢安神方中剂量组、合欢安神方高剂量组和艾司唑仑组，对照组予等剂量生理盐水干预，中药组分别予合欢安神方低、中、高剂量灌胃，模型组予等量生理盐水灌胃，艾司唑仑组予艾司唑仑（0.21mg/Kg）灌胃，持续干预1周。分别于造模前3天、造模后1h、干预1周后进行行为学测试，行为学测试结束后，HE检测观察小鼠肝肾形态学改变，验证合欢安神方的生物安全性。 结果: 1、造模前，自主活动实验（LocomotorActivity）结果显示，各组总路程、总平均速度、不动时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）;说明各组造模前自主活动行为无统计学意义，基线一致。2、干预一周后，自主活动结果显示，与对照组相比较，模型组总路程、总平均速度降低，不动时间增多，差异有统计学差异（P＜0.05）;与模型组比较，合欢安神方低、中、高剂量组和艾司唑仑组总路程、平均速度明显提高，不动时间明显缩短，差异有统计学差异（P＜0.05）。戊巴比妥钠翻正实验结果显示，与对照组相比较，模型组小鼠的睡眠潜伏期显著延长，睡眠时间显著缩短，差异具有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较，合欢安神方低、中、高剂量组和艾司唑仑组小鼠睡眠潜伏期显著缩短，睡眠时间显著延长，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）,而合欢安神方低、中、高剂量组与艾司唑仑组和对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。肝脏和肾脏HE结果显示:合欢安神方干预1周后，与对照组比较，模型组、中药低剂量、中药中剂量组及艾司唑仑组肝脏HE镜下肝细胞无炎症细胞浸润，肝细胞多，胆管少，肝小叶结构完整，无明显脂肪浸润，肾脏HE镜下小球正常，肾小管上皮细胞无肿胀和空泡样变性，而中药高剂量组肝脏HE镜下有少量炎细胞润，肝小叶间胆管增生，肾脏HE镜下有少量炎细胞润，肾小球基本正常，肾小管上皮细胞轻度肿胀和空泡样变性。 结论: 1、通过腹腔注射PCPA法可以成功建立失眠小鼠模型，戊巴比妥钠翻正实验验证造模是否成功，肝肾HE染色实验验证腹腔注射PCPA对小鼠肝肾无明显损害， 2、行为学实验表明合欢安神方低剂量、中剂量及高剂量和艾司唑仑可以缩短小鼠睡眠潜伏期及延长睡眠时间，从而改善小鼠失眠症状;且肝肾HE染色实验验证合欢安神方中剂量组(即成人等效剂量)肝肾无明显损害，即合欢安神方用药安全，无明显毒副作用。 实验二合欢安神方对PCPA失眠小鼠模型下丘脑病理表达及下丘脑PGD2、D1R、5-HT、GABA的表达影响 目的:探讨合欢安神方对PCPA失眠小鼠模型下丘脑病理表达及下丘脑PGD2、D1R、5-HT、GABA的表达的作用机制。 方法:本研究通过PCPA法建立失眠动物模型(通过预实验摸得造模浓度为0.8g/Kg),将60只SPF雄性小鼠随机分为对照组、模型组，连续4天腹腔注射PCPA造模成功后，模型组小鼠再随机分为模型组、中药组和西药组，对照组予生理盐水干预，中药组予合欢安神方(2.7g/Kg)灌胃，模型组予生理盐水灌胃，西药组予艾司唑仑(0.21mg/Kg)灌胃，持续干预1周。分别于造模前3天、造模后1h、干预1周后进行行为学测试，行为学测试结束后，HE检测观察小鼠下丘脑形态学改变。免疫蛋白印迹法(WesternBlot,WB)检测各组小鼠下丘脑PGD2、D1R、5-HT、GABA蛋白表达水平。定量聚合酶链反应(quantitativepolymerasechainreaction，qPCR)实验检测各组小鼠下丘脑PGD2mRNA、D1RmRNA、5-HTmRNA、GABAmRNA表达水平。 结果: 1、行为学结果显示，戊巴比妥钠翻正实验结果显示，与对照组比较，模型组小鼠的睡眠潜伏期明显延长，睡眠时间明显缩短，差异均有统计学差异(P＜0.001);与模型组对比，合欢安神方组及艾司唑仑组小鼠的睡眠潜伏期显著缩短，小鼠的睡眠时间显著延长，差异均有统计学意义(P＜0.01);与艾司唑仑组比较，合欢安神方组的睡眠潜伏期及睡眠时间无明显改变，差异均无统计学差异(P＞0.05)。自主活动实验显示，与对照组相比，模型组小鼠的总路程、总区域平均速度、四角路程、四角平均速度、四边路程、四边平均速度明显降低，总不动时间显著增加，差异均有统计学意义(P＜0.001);与模型组比较，合欢安神方组及艾司唑仑组小鼠的总路程、总区域平均速度、四角路程、四角平均速度、四边路程、四边平均速度明显升高，不动时间明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.001);与艾司唑仑组比较，合欢安神方组小鼠的总路程、总区域平均速度、四角路程、四角平均速度、四边路程、四边平均速度及不动时间无明显改变，差异均无统计学差异(P＞0.05)。 2、HE染色结果示，对照组:小鼠大脑下丘脑神经元细胞排布整齐紧密，层次清晰，细胞数量较多，胞质均质红染，核大而圆，核仁清晰;模型组:神经元细胞分布少，核仁小，细胞核染色深，核仁固缩;合欢安神方组及艾司唑仑组:神经元细胞排列较整齐，胞质较均匀。 3、透射电镜结果示，对照组:细胞核膜清晰，染色质分布均匀，线粒体结构清晰，粗面内质网丰富;模型组:细胞核膜模糊不清，线粒体变小且皱缩，嵴减少或消失，溶酶体增多，基质空化，核糖体聚集;合欢安神方组及艾司唑仑组:细胞核膜欠清晰，染色质分布较均匀，线粒体嵴增加，结构清晰。 4、Westernblot结果显示，与对照组比较，模型组小鼠下丘脑PGD2、5-HT、GABA蛋白表达降低，D1R蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,合欢安神方组及艾司唑仑组小鼠下丘脑PGD2、5-HT、GABA蛋白表达升高，D1R蛋白表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与艾司唑仑组相比，合欢安神方组小鼠下丘脑PGD2、5-HT、GABA蛋白表达升高不明显，D1R蛋白表达明显降低不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)。 5、qPCR结果显示,与对照组比较，模型组小鼠下丘脑PGD2mRNA、5-HTmRNA、GABAmRNA表达明显降低，D1RmRNA表达明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05);与模型组相较，合欢安神方组及艾司唑仑组小鼠下丘脑PGD2mRNA、5-HTmRNA、GABAmRNA表达升高，D1RmRNA表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与艾司唑仑组相比，合欢安神方组小鼠下丘脑PGD2mRNA、5-HTmRNA、GABAmRNA表达升高不明显，D1RmRNA表达明显降低不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论:腹腔注射PCPA能够使下丘脑神经元细胞结构改变，以及睡眠觉醒相关蛋白表达改变，合欢安神方可能通过上调PGD2、5-HT、GABA蛋白表达，抑制D1R蛋白表达，修复损伤的下丘脑神经细胞，最终改善失眠模型小鼠的失眠行为变化，并缩短失眠模型小鼠的睡眠潜伏期且延长睡眠总时间。
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