摘要
目的:探究冠心病及其痰瘀互结证的肠道菌群及代谢物特征，寻找其生物标志物,并评价其预测价值，揭示稳定型冠心病、不稳定性心绞痛及冠心病痰瘀互结证的生物学基础及证候本质，为冠心病及痰瘀互结证的临床诊疗提供客观指标和评价依据，并为其机制研究提供数据支持和新的视角。 方法: 1.借助CiteSpace和VOSviewer分析软件分别对冠心病在微生物组、代谢组及中医证候研究领域的发文量、引用量、关键词等进行可视化文献计量学分析，探究冠心病在微生物组、代谢组学及中医证候领域的研究概况、热点及前沿，为科研选题提供科学依据、参考方向和研究思路。 2.以170名拟行冠状动脉造影术的住院患者为研究对象，根据冠状动脉造影结果将其分为稳定型冠心病组、不稳定性心绞痛组及非冠心病组。将其中137名冠心病患者分为痰瘀互结证组和非痰瘀互结证组。收集受试者同期的血液、粪便样本及临床资料。结合第一部分的分析结果，借助液相色谱-质谱分析方法进行靶向代谢组学检测。分析各组间差异代谢物，并评估其对稳定型冠心病、不稳定性心绞痛及冠心病痰瘀互结证的预测价值。采用单因素及多因素Logistic回归分析，校正潜在混杂因素，评价其是否可以作为冠心病不同临床分型及痰瘀互结证的危险因素。通过随机森林分析进一步筛选冠心病痰瘀互结证的潜在生物标志物，并将样本随机分为训练集及验证集，对分析结果进行验证。 3.采用16SrRNA高通量基因测序技术分析稳定型冠心病、不稳定性心绞痛及冠心病痰瘀互结证患者的肠道微生物构成特点。进行物种分类和丰度分析、α多样性和β多样性分析。运用LEfSe分析及随机森林分析组间差异肠道菌群，选取两种分析方法的组合结果，以筛选相对更稳健的生物标志物，并评价其预测价值。采用Spearman相关性分析差异菌属之间、差异菌属与差异代谢物之间的关联，并观察其构建联合诊断模型对稳定型冠心病、不稳定性心绞痛、冠心病痰瘀互结证的诊断效能。 结果: 1.微生物组、代谢组及中医证候在冠心病的研究领域受到越来越多研究者的关注。肠道微生物组、氧化三甲胺、色氨酸相关代谢产物及冠心病痰瘀互结证的证候生物学基础是冠心病研究领域的热点及趋势。 2.通过靶向代谢组学检测氧化三甲胺及色氨酸相关代谢产物，发现稳定型冠心病组及不稳定性心绞痛组患者的三甲基赖氨酸、三甲基-5-氨基戊酸、胆碱、5-羟基色氨酸水平均显著高于非冠心病组(P＜0.05)。稳定型冠心病及不稳定性心绞痛与非冠心病组间差异代谢物的曲线下面积(Areaundercurve,AUC)分别为0.612-0.696及0.622-0.712，组间差异代谢物的联合诊断模型的AUC分别为0.762和0.863,能够更好地将稳定型冠心病及不稳定性心绞痛患者与非冠心病人群进行区分。相对于冠心病非痰瘀互结证组，氧化三甲胺、三甲基-5-氨基戊酸、L-Carnitine在冠心病痰瘀互结证组的浓度均显著升高(P＜0.05),两组受试者工作特征曲线分析结果显示AUC为0.603～0.808,其中三甲基-5-氨基戊酸对冠心病痰瘀互结证的诊断效能最高(AUC=0.808,95％CI:0.730-0.886,P＜0.001)。采用单因素及多因素Logistic回归分析，校正潜在混杂因素，发现三甲基-5-氨基戊酸为稳定型冠心病、不稳定性心绞痛及冠心病痰瘀互结证的独立危险因素(OR＞1)。随机森林分析结果提示三甲基-5-氨基戊酸、三甲基赖氨酸、黄嘌呤酸为冠心病痰瘀互结证与非痰瘀互结证分组贡献排名前三位的代谢物。其中三甲基-5-氨基戊酸水平被发现在训练集的冠心病痰瘀互结证组中显著升高(P＜0.001),对区分冠心病痰瘀互结证患者和非痰瘀互结证患者具有较好表现(AUC=0.825),以上结果在验证集的样本分析中得到验证(AUC=0.774)，提示三甲基-5-氨基戊酸可能作为冠心病痰瘀互结证的潜在风险生物标志物。 3.基于肠道菌群高通量测序研究发现，除Observedspecies指数(P=0.038)外，表征α多样性的各指数在稳定型冠心病、不稳定性心绞痛患者及非冠心病受试者三组间的差异均无统计学意义。布克氏菌属Burkholderia、红球菌属Rhodococcus、节细菌属Arthrobacter在稳定型冠心病及不稳定性心绞痛组的AUC均达到0.70以上。相对于非冠心病组，稳定型心绞痛及不稳定性心绞痛组差异菌属的联合诊断模型的AUC分别为0.885(95％CI:0.801-0.969,P＜0.001)及0.954(95％CI:0.912-0.996,P＜0.001)。栖粪杆菌属Faecalibacterium、多尔氏菌属Dorea、副杆菌属Parabacteroides为对冠心病痰瘀互结证组和非痰瘀互结证组具有较大分组贡献的差异菌属，差异菌属联合诊断模型的AUC为0.717(95％CI:0.605-0.829,P=0.001)。以上结果提示肠道微生物对冠心病不同亚型及其痰瘀互结证均具有较好的鉴别潜力。肠道菌群及代谢物构建的联合诊断模型在稳定型冠心病组/不稳定性心绞痛vs.非冠心病组及痰瘀互结证组vs.非痰瘀互结证组的AUC分别为0.936(95％CI:0.885-0.986,P＜0.001)、0.956(95％CI:0.910-1.000,P＜0.001)及0.901(95％CI:0.813-0.989,P＜0.001),均达到0.90以上。提示肠道菌群及其代谢产物对稳定型冠心病、不稳定性心绞痛患者均可进行良好的区分。肠道菌群与代谢物的关联分析提示Ruminococcus和TMAO相关性最显著(r=0.29,P＜0.01),冠心病痰瘀互结证组的优势菌属多尔氏菌属Dorea、副杆菌属Parabacteroides与三甲基-5-氨基戊酸呈正相关。 结论:本课题基于肠道微生物组学及菌群代谢物靶向代谢组学揭示了冠心病不同亚型及其痰瘀互结证患者肠道微生物结构紊乱以及三甲基赖氨酸、三甲基-5-氨基戊酸、色氨酸代谢产物的浓度变化。布克氏菌属Burkholderia、多尔氏菌属Dorea等肠道菌属及三甲基-5-氨基戊酸等代谢物可能为稳定型冠心病、不稳定性心绞痛及冠心病痰瘀互结证的生物标志物。本研究为冠心病及其痰瘀互结证的防治提供新的思路和客观评价依据，对探索冠心病痰瘀互结证生物学基础和临床诊疗具有重要意义。
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