摘要
目的: 脑是高血压靶器官损伤的早期目标之一，高血压会增加脑卒中、阿尔兹海默症等急、慢性脑部疾患的患病风险，严重影响人们的生活质量。目前，除控制血压外，尚无更好的方法预防高血压脑损伤。本研究主要观察牛膝水提物对高血压脑损伤大鼠模型的药效作用。然后应用转录组测序技术探索牛膝发挥脑保护作用的可能信号通路。同时，运用16SrRNA基因测序技术对牛膝发挥脑保护作用的潜在途径进行探索。 方法: 1.首先将24只9周龄雄性SHR大鼠随机分为模型组(MD)、牛膝组(AB)、阳性药组(LB),饲养至44周龄，构建高血压脑损伤大鼠疾病模型。另有8只同等周龄的WKY大鼠作为正常对照组(NC)。AB组及LB组从第10周龄开始灌胃给药至第44周龄。过程中每周测量一次体重，每5周测量一次血压，直至实验结束。HE染色法、尼氏染色法观察各组大鼠脑组织皮层部位、海马部位的病理变化，电镜观察海马神经元的超微结构变化。ELISA法检测各组血清中的NO、ET-1、AngⅡ、GSH、5-HT及S100β的含量。采用Spearman相关性分析分析各血清指标与脑组织病理评分的关联性。判断各给药组的药效作用。 2.根据转录组学对牛膝发挥脑保护作用的可能机制进行探索研究。取每组5只大鼠的脑组织进行转录组测序，以获得各组样本的表达基因。测序完成后，将MDvsNC与ABvsMD的测序结果进行差异基因分析与通路注释富集分析，并根据富集分析的结果，推测牛膝发挥脑保护作用的可能机制。Westernblot与免疫组织化学法验证通路相关的关键蛋白:PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT。 3.运用16SrRNA基因测序技术探索牛膝对高血压脑损伤大鼠模型肠道菌群的调控作用，对牛膝发挥脑保护作用的可能机制进行研究。取每组8只大鼠的结肠内容物进行测序，测序完成后，分析各组大鼠肠道菌群的物种组成结构、多样性等，并对AB组进行功能预测分析。 4.对实验初期与实验终点的肠道菌群进行纵向比较分析，进一步明确高血压脑损伤相关的肠道细菌以及牛膝对肠道菌群的影响。 结果: 1.根据各组大鼠血压测量结果，发现MD组相对于NC组，收缩压显著升高，44周龄时，收缩压达(199.69±0.44)mmHg,而AB组相对于MD组，收缩压仅显著下降至(184.05±0.58)mmHg，LB组相对于MD组，收缩压显著下降至(140.48±0.34)mmHg。根据各组大鼠脑组织皮层、海马部位HE染色、尼氏染色以及电镜观察超微结构的结果，我们发现MD组相对于NC组，大鼠脑组织皮层与海马部位出现神经元固缩深染、排列不规则、HE染色病理评分显著上升，尼氏小体光密度值显著减少等病理变化，表明高血压脑损伤大鼠模型在SHR44周龄时成功建立。AB组相对于MD组，脑组织病理变化得到显著改善，HE染色评分显著下降，皮层与海马部位尼氏小体光密度值显著上升。LB组相对于MD组，脑组织病理变化得到显著改善，HE染色评分显著下降，仅皮层部位尼氏小体光密度值显著上升。在对血清中NO、ET-1、AngⅡ、GSH、5-HT及S100β进行检测后发现，MD组相对于NC组，血清中NO、5-HT及GSH的含量显著下降，AngⅡ、ET-1与S100β的含量显著上升。AB组相对于MD组，均显著上升NO、GSH、5-HT的含量，显著下调AngⅡ、ET-1与S100β的含量。LB组相对于MD组，显著上升NO、GSH、5-HT的含量，显著下调AngⅡ、S100β的含量，但对ET-1调节作用不明显。Spearman相关性分析发现皮层与海马部位病理评分与NO、GSH、5-HT成显著负相关，与AngⅡ、S100β、ET-1成显著正相关。结合各给药组的脑组织病理改善结果与血清中相关指标的变化，我们发现牛膝在改善高血压脑损伤方面作用效果优于阳性药。 2.转录组测序结果中，通过比较AB组与MD组的基因表达数据，我们发现，相对于MD组,AB组显著上调的基因有568个，显著下调的基因有572个。在富集分析中，MD组相对于NC组、AB组相对于MD组的差异基因均富集到PI3K-AKT信号通路。Westernblot与免疫组织化学法显示，MD组相对于NC组，p-PI3K/AKT的表达量具有上升趋势，p-AKT/AKT的表达量显著上升，PI3K与AKT的表达量无明显变化，给药后，AB组相对于MD组，p-PI3K/PI3K与p-AKT/AKT的表达量显著上升。 3.实验终点肠道菌群横断面分析结果显示，高血压脑损伤大鼠模型肠道菌群出现明显紊乱，表现为有害菌丰度升高及有益菌丰度降低，而牛膝则改善了这一紊乱，阳性药无明显调控肠道菌群作用。另一方面，牛膝富集到的多种细菌与5-HT成显著相关或显著回归关系，提示牛膝可能能够通过改善肠道菌群从而调节微生物-肠-脑轴。此外，PICRUST功能预测分析结果显示AB组可能通过类黄酮生物合成、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、醚脂质代谢等代谢途径调整MD组大鼠的肠道微生物功能异常。 4.实验初始与实验终点纵向的肠道菌群分析结果显示，实验终点相比于实验初期，MD组F/B比值显著升高。各处理组中，AB组对于肠道菌群的调控作用更明显。在排除可能与周龄有关的差异菌后，发现DefluviitaleaceaeUCG-011、Clostridium_sensu_stricto_1等的増加以及Lactobacillus等丰度的显著减少与高血压脑损伤大鼠模型显著相关。牛膝能够显著降低Jeotgalicoccus、Desulfovibrio、Staphylococcus等有害菌的丰度，同时显著增加Bifidobacterium、Akkermansia、Faecalibaculum等有益菌的丰度。而阳性药在富集到部分有益菌的同时也显著上调了有害菌的丰度。 结论: 本研究中，在44周龄时，SHR大鼠表现出明显的脑损伤，高血压脑损伤大鼠模型成功建立;牛膝能够改善高血压脑损伤大鼠模型出现的脑组织病理变化。血清指标显示，牛膝显著下调了颅脑损伤相关指标S100β的血清浓度;并能够通过调控ET-1与NO的平衡从而维持血管稳态;同时牛膝还能够上调抗氧化物质GSH以及神经递质5-HT等的血清水平，表明牛膝可能具有直接的神经保护作用。转录组学提示，牛膝可能通过多种途径发挥脑保护作用。此外，高血压脑损伤大鼠模型伴随肠道菌群紊乱的特征，主要表现为有害菌的增加和有益菌的减少,牛膝能够对肠道菌群产生有益影响，并可能通过这一途径调控微生物-肠-脑轴，从而发挥脑保护作用。综上，牛膝在高血压脑损伤进程中的脑保护功效可能是多方面调控机制共同作用的。
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