摘要
氮是植物正常生长所必需的大量营养元素之一。氮肥的出现为作物产量的提高与稳定提供了重要保障，然而过量施用氮肥带来了资源浪费、种植成本增加以及环境污染等问题。通过鉴定氮吸收利用调控基因，挖掘作物自身氮营养遗传潜力，培育氮高效品种是解决以上问题的有效途径之一。甘蓝型油菜（BrassicanapusL.）是世界上重要的油料作物之一，有着较高的氮肥需求和较低的氮效率（Nitrogenuseefficiency,NUE）。课题组前期研究发现氮高效油菜品种‘浙油18’（编号为48）开花后叶片脱落酸（abscisicacid,ABA）含量高于氮低效油菜品种‘Sollux’（编号为44）。本研究将明确这两种基因型油菜对外源ABA处理的响应模式，并采用转录组学技术鉴定油菜氮效率相关调控基因。通过分子生物学与生理生化等方法研究其参与氮素吸收利用调控的生物学功能，为通过生物技术培育氮营养高效利用或者耐低氮的油菜新品种提供理论依据，对氮肥减施、农业可持续发展及生态环境保护具有重要意义。取得以下主要研究结果： 1.不同氮效率油菜品种以及油菜地上部与根系对外源ABA处理有着不同的响应模式。通过盆栽试验发现，外源ABA喷施叶片能够促进营养器官中的氮向籽粒的再分配来增加每角粒数进而促进氮高效油菜（48）单株籽粒产量与氮利用效率，而氮低效油菜（44）则呈现出相反的变化趋势。水培条件下，用ABA处理开花后的两种基因型油菜并进行转录组测序。结果显示，在正常条件下，48根系中部分氮代谢基因（NRT2s,NAR2s,NRs,NiR,GDHs,GSs）的表达量高于44，而ABA处理后其中大部分基因表达量则低于44。 2.油菜高亲和性NO3－转运蛋白基因NRT2s及其分子伴侣NAR2s与氮代谢酶编码基因（NRs,NiRs,GDHs,GSs）被鉴定为氮效率相关候选基因。对48和44之间的差异表达基因进行KEGG功能富集分析，显著富集到了氮代谢、硫代谢、ABC转运蛋白与MAPK信号转导等关键信号通路。氮代谢通路中主要涉及到的基因有：高亲和性NO3－转运蛋白基因NRT2s及其伴侣蛋白基因NAR2s、硝酸还原酶基因NRs、亚硝酸还原酶基因NiRs、谷氨酸脱氢酶基因GDHs及谷氨酰胺合成酶基因GSs。此外，WGCNA鉴定出与48根系显著相关的两个模块，其中的核心基因主要包括氨基酸转运蛋白基因AAPs、ABA信号转导核心组分ABF3/4及ABA响应基因NF-YC等。 3.过表达BnaC8.NRT2.1b能显著提升atnrt2.1植株的NUE与油菜植株的氮吸收效率（Nitrogenuptakeefficiency,NUpE），并且过表达BnaC2.NAR2.1能显著提升atnar2.1与油菜植株的NUpE。我们将差异表达基因BnaC8.NRT2.1b与BnaC2.NAR2.1进行功能研究。结果表明，正常条件下BnaC8.NRT2.1b仅在根系局部区域、叶片边缘与雄蕊中少量表达，而其受低氮胁迫后在整个根系中大量表达。在正常条件下，BnaC2.NAR2.1在整个根系与叶片以及雄蕊中均大量表达。BnaC8.NRT2.1b与BnaC2.NAR2.1均为膜定位蛋白，并且存在互作。与野生型植株相比，过表达BnaC8.NRT2.1b能够将atnrt2.1突变体在低氮条件下的单株籽粒产量、整株氮累积量、NUpE以及NUE分别提升50%、41%、41%与50%；过表达BnaC2.NAR2.1能够将atnar2.1突变体在低氮条件下的植株氮累积量与NUpE均提升32%。与之相似的是过表达BnaC8.NRT2.1b与BnaC2.NAR2.1均能显著提升苗期油菜植株的NUpE。 4.BnaA5.AIB（BnaA05g01330D）是油菜氮吸收利用的负调控因子。对处于花期的48与44进行低氮处理并进行转录组测序。将RNA-seq结果与课题组前期取得的BSA-seq结果综合分析后，筛选出47个候选基因。进一步分析发现，其中一个被注释为受ABA诱导的bHLH类的转录因子BnaA5.AIB在根系大量表达。BnaA5.AIB在48根系中的表达量低于44，并且其编码蛋白在48与44之间存在4个氨基酸突变。该基因对应拟南芥同源基因AtAIB的突变体aib在低氮条件下的主根显著长于野生型，以及植株氮累积量显著高于野生型。GUS组织化学染色结果表明BnaA5.AIB主要在叶片、根尖、及花朵中大量表达，其编码蛋白定位于细胞核。在拟南芥中过量表达BnaA5.AIB能够显著降低成熟期植株NUpE与NUE；在油菜中过表达BnaA5.AIB能够显著降低苗期植株的NUpE。此外，BnaA5.AIB在48与44之间的差异表达以及氨基酸位点的非同义突变可能是导致这两个不同品种油菜的氮效率出现显著差异的遗传调控机制之一。 5.ABA-BnaA5.AIB-BnaC2.NAR2.1分子模块参与调控油菜氮吸收。双荧光素酶与酵母单杂交试验结果表明BnaA5.AIB能够直接结合BnaC2.NAR2.1启动子区域中的CAATTG元件并抑制其表达。ABA处理能够促进BnaA5.AIB表达，却抑制BnaC2.NAR2.1的表达；此外在BnaA5.AIB过表达株系中，BnaC2.NAR2.1的表达量降低。以上结果鉴定出ABA-BnaA5.AIB-BnaC2.NAR2.1分子通路参与油菜氮吸收的调控。
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