摘要
目的: 通过体外实验方式研究由黄芪、通关散、重楼、白花蛇舌草等药物组成的彝医验方——齐苏散结方(QISUSANJIEDecoction,QSD)对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响，同时观察齐苏散结方对PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白和分子表达的影响探讨齐苏散结方治疗肝癌可能的作用机制，为齐苏散结方的进一步开发应用提供实验基础，也为患癌人群提供更多的医疗选择。 方法: 1.采用CCK-8法、流式细胞术检测齐苏散结方对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡作用:取对数生长期细胞铺板后按对照组(完全培养基组)、齐苏散结方低、中、高剂量组(4、8、16mg/mL)处理细胞，分别于细胞给药24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8试剂，避光孵育1h后使用酶标仪测定420nm处OD值，并计算细胞增殖率。将对数生长期细胞按铺板后按对照组、齐苏散结方低、中、高剂量组48h后，处理结束加入AnnexinⅤ-FITC、PI试剂对细胞双染，后使用流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡率。 2.采用RT-PCR法、WesternBlot法检测齐苏散结方对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响:取对数生长期细胞铺板后按对照组、齐苏散结方低、中、高剂量组处理48h,处理结束使用Trizol提取RNA,将RNA逆转录为cDNA后采用RT-PCR法检测细胞中PI3K、AKT、mTORmRNA表达量。将对数生长期细胞传代至培养瓶，待传代细胞密度达60％时按对照组、齐苏散结方低、中、高剂量组处理细胞，处理结束使用Ripa裂解液提取蛋白，检测细胞中PI3K、AKT、mTOR表达水平以及磷酸化PI3K、AKT、mTOR的表达水平。 结果: 1.CCK-8法结果表明:齐苏散结方对人肝癌HepG2细胞有明显的抗肿瘤活性,可有效的抑制肝癌细胞的增殖，各组间有明显差异(P＜0.05),齐苏散结方对人肝癌HepG2细胞的抑制有药物浓度及时间依赖性，即齐苏散结方浓度越高、处理时间越长，细胞活性越低。 2.流式细胞术结果表明，齐苏散结方可诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡，其中高剂量组的凋亡率最高，低剂量组与对照组比较无明显差异，肝癌细胞凋亡率与齐苏散结方浓度呈正相关。 3.RT-PCR法结果显示，齐苏散结方处理后人肝癌HepG2细胞中PI3K、AKT、mTORmRNA的表达量较对照组相比有所下降，其中，齐苏散结方对AKTmRNA的抑制最为明显，各mRNA的表达量随药物浓度的增加不断降低; 4.WesternBlot法检测发现齐苏散结方处理后人肝癌HepG2细胞中PI3K、AKT、mTOR及磷酸化PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达量均有不同程度的下调，其中，齐苏散结方对p-AKT的影响尤为显著，随着药物浓度的提高，各个蛋白质的表达量逐渐降低。 结论: 1.齐苏散结方对肝癌细胞生长有明显的抑制作用，可诱导肝癌细胞凋亡; 2.齐苏散结方可下调肝癌HepG2细胞中PI3K、AKT、mTORmRNA的表达量，并降低PI3K、AKT、mTOR和磷酸化PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达水平，从而证实齐苏散结方能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路来抑制肝癌细胞的增殖并诱导其凋亡的发生。
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