摘要
慢性淋巴细胞白血病（chroniclymphocyticleukemia,CLL）是临床最常见的血液系统肿瘤之一，是一种具有特定免疫表型的成熟小B细胞淋巴瘤，其生物学行为和临床转归均存在高度的异质性。既往文献报道，凋亡通路受阻、B细胞受体通路等致癌信号通路的异常激活是CLL疾病的显著特征。针对于此，近年来逐步开发出BCL2抑制剂（如venetoclax）、BTK激酶抑制剂（如ibrutinib）等小分子靶向抑制剂。尽管随着近年来靶向治疗的发展和进步，CLL治疗有效率得到进一步提高;然而，仍有部分复发/耐药CLL患者即使接受新型靶向药物及高强度联合化疗等挽救性治疗，也难以获得长期生存。由于CLL的具体发病机制在全球范围尚不十分明确，因此，仍需要大力发展CLL治疗及预后新靶标的相关临床前研究，瞄准CLL发病机制过程中的关键节点，以进一步改善CLL疾病危险度分层和治疗评估，指导CLL的个体化靶向治疗。 研究发现，肿瘤细胞中DNA因复制压力或应激等造成的DNA损伤频繁发生，恶性细胞可以通过DNA损伤应答通路（DNAdamageandresponse，DDR）的激活，修复未经检查的复制压力造成的DNA损伤，从而利于肿瘤的生存。ATM/TP53突变是CLL中常见的高危突变，与CLL细胞基因组不稳定、克隆进化和治疗抵抗具有显著相关性，严重影响CLL患者的预后及生存。带有ATM/TP53突变的患者往往难治/复发，且与侵袭性淋巴瘤（Richter综合征）转化显著相关。近来研究表明，DDR通路的异常可以降低肿瘤细胞对DNA损伤刺激因子的敏感性，从而诱导CLL的治疗抵抗，在肿瘤耐药中发挥关键作用，抑制DDR通路是一种很有前景的联合治疗方法。深入研究CLL诊疗的新型预后靶点及耐药机制，探索新的高效联合用药方案，不仅是CLL临床及基础研究的热点，更具有重大的科学意义和潜在的临床应用前景。 第一部分CTPS2介导DNA损伤应答促进慢性淋巴细胞白血病发生发展 研究背景 三磷酸胞苷合成酶2(Cytidinetriphosphatesynthase,CTPS2)是催化CTP合成的关键限速步骤之一，而CTP在细胞能量代谢以及核酸、磷脂和膜的生物合成中具有关键作用。越来越多的证据表明，CTP合成酶在多种癌症中存在异常调控。据文献报道，EBV病毒可以通过促进CTPS2表达以满足受感染的B细胞对CTP的代谢需求，进而促进淋巴瘤的发生。然而，CTPS2在CLL发生中的具体作用机制和临床意义仍是一个悬而未决的问题。 在本研究中，我们提供了CTPS2促进CLL发生发展的可靠理论依据，即CTPS2不仅能够增强CLL细胞的增殖，阻碍细胞凋亡，而且可以与DNA损伤修复因子BRCA1相互作用，导致CLL中的DDR通路的异常激活。这些结果为CLL的病理生理学发病机制开辟了新的视角，可用于开发生物标志物以指导CLL的治疗选择。 研究目的 本研究旨在探讨CTPS2在CLL疾病中的作用和临床意义以及参与CLL发生发展的分子机制。结合公共数据库及临床标本分析，通过体外实验结果，证实CTPS2在CLL发生发展中的致癌作用，阐明CTPS2通过与BRCA1相互作用调控DDR通路从而促进CLL发生发展。 材料与方法 1.基于公共数据库如GEO数据库、ICGC数据库中进行CLL患者CTPS2的生物信息学分析; 2.收集初治CLL患者的外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCells,PBMCs)样本及临床信息; 3.健康供者的外周血单个核细胞分离，并检测其中CD19+细胞的含量及纯度; 4.细胞总RNA提取及纯化，反转录实验及实时荧光定量聚合酶链反应(Real-timePolymeraseChainReaction,qPCR); 5.CLL细胞系及原代细胞培养; 6.蛋白提取、免疫印迹(Westernblotting，WB); 7.慢病毒载体介导CTPS2的敲减; 8.Cellcountingkit-8(CCK-8)检测CLL细胞增殖; 9.PI/RNase法检测细胞周期; 10.AnnexinⅤ-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡水平; 11.RNA测序（RNA-seq）技术; 12.彗星实验; 13.免疫荧光及共聚焦显像; 14.统计学分析。 研究结果 1.qPCR及WB结果显示，相对于正常B细胞,CTPS2在96例CLL患者及CLL细胞系MEC-1及EHEB中表达显著上调（p＜0.01）;CLL患者的CTPS2异常高表达在数据库GSE5006,GSE22529及GSE55288均得到证实。 2.卡方检验显示CTPS2高表达与CLL患者血清LDH水平升高（p=0.011）、IGHV未突变（p=0.021）及FISH不良预后指标（11q-和/或17p-,p=0.038）具有统计学相关性;此外，Kaplan-Meier生存分析显示高表达CTPS2的CLL患者总生存短于低表达CTPS2的患者（p=0.03）。 3.与转染阴性对照慢病毒的对照组比较,CTPS2敲减组的CLL细胞增殖能力降低（48h,72h均p＜0.001）,G2/M细胞周期阻滞（p＜0.05）,细胞凋亡率升高（p＜0.001）。 4.过表达CTPS2及外源性CTP加入均可以部分回复由Gln缺乏引起的CLL细胞系及原代细胞的增殖抑制及凋亡受阻。 5.转录组测序结果提示CTPS2参与CLL细胞的DNA损伤修复过程，荧光共定位及Co-IP实验证实CTPS2与BRCA1直接相互作用，从而参与DNA损伤修复通路的激活。过表达BRCA1可以挽救由CTPS2敲减引起的DNA损伤标志的减少，包括磷酸化H2AX表达减低及彗星实验拖尾减少。 研究结论 CTPS2在CLL中显著高表达，且与患者的临床特征、疗效不佳及预后不良具有密切相关性。CTPS2通过参与CLL细胞的增殖、凋亡、周期等生物学过程介导CLL的发生发展。靶向CTPS2可通过促进CLL细胞DNA损伤并影响修复而抑制细胞增殖、促进细胞周期阻滞及细胞凋亡进程。研究结果表明CTPS2有望成为新型CLL治疗的分子靶点和疾病进展及预后的生物标志物。 第二部分FTO介导CtBP1m6A去甲基化修饰在慢性淋巴细胞白血病发生发展中的机制研究 研究背景 m6A是真核生物mRNA及lncRNA含量最多的甲基化修饰形式。m6A甲基化修饰是动态的过程，作为RNA表观遗传修饰最常见的修饰形式之一，能在转录后水平调控RNA定位、运输、剪接、翻译和降解等过程。脂肪团和肥胖相关基因(fatmassandobesityassociated，FTO)基因位于第16号染色体(16q12.2)是最先被鉴定的m6A去甲基化酶。随着研究的深入，近期发现FTO介导的m6A去甲基化修饰除与脂肪代谢、神经发育等相关外，还与肿瘤发生发展及耐药密不可分。然而，FTO在不同肿瘤中的表达并不一致，据报道，FTO在急性髓系白血病、肺癌、子宫内膜癌等肿瘤中显著高表达并促进癌症进展，而FTO在部分肝内胆管癌中却表现为低水平。目前尚未有研究报道FTO及其靶向抑制剂FB23-2在慢性淋巴细胞白血病中的作用及分子机制。 研究目的 本研究结合公共数据库及临床标本分析，通过体内及体外实验结果，探究FTO在CLL发生发展中的作用及机制，阐明FTO介导DDR通路调控CLL细胞对伊布替尼药物敏感性的分子机制，并探讨FTO抑制剂FB23-2联合伊布替尼治疗CLL的临床转化潜力。 材料与方法 1.收集初治CLL患者PBMC样本及临床信息; 2.CD19+细胞的分离和纯度检测; 3.RNA提取，逆转录及qPCR实验; 4.CLL细胞培养; 5.蛋白提取及免疫印迹(Westernblot，WB); 6.Cellcountingkit-8(CCK-8)检测CLL细胞的增殖水平; 7.PI/RNase法检测细胞周期; 8.AnnexinⅤ-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡水平; 9.慢病毒转染构建FTO敲减的稳转株; 10.RNA测序(RNA-seq)技术; 11.CLL异种移植小鼠模型构建; 12.免疫组织化学染色(IHC)及苏木素伊红(HE)染色; 13.小动物活体成像技术; 14.m6A甲基化RNA免疫共沉淀（meRIP）实验及测序; 15.RNA免疫共沉淀实验（RIP）; 16.统计学分析。 研究结果 1.qPCR及WB结果显示，相对于正常B细胞，FTO在95例CLL患者中表达显著上调（p＜0.05），且与CLL患者的总生存缩短显著相关（p=0.03）。 2.FTO靶向抑制剂FB23-2能够显著抑制CLL细胞系及原代细胞的增殖，且呈时间-剂量依赖性;FB23-2处理CLL细胞后，细胞周期阻滞于G1/S期，细胞凋亡率增多。 3.通过meRIP测序与转录组测序联合分析，初步筛选了CtBP1作为潜在的FTO下游靶分子，经过后续meRIP-PCR及RIP-PCR实验鉴定了FTO可与CtBP1mRNA直接结合并介导其m6A修饰。 4.敲减FTO显著影响了CtBP1的表达;随后RNA稳定性实验证实，FTO通过介导CtBP1的mRNAm6A去甲基化修饰，显著延长了CLL细胞中CtBP1mRNA的半衰期，增加其稳定性。 5.在体外实验中，抑制FTO能够显著增加CLL细胞对伊布替尼的药物敏感性。两药联用组细胞增殖显著受抑，细胞凋亡率明显增加;加用FB23-2处理后的CLL细胞中DNA损伤标记物p-H2AX及p-ATM的表达水平升高，而联合慢病毒介导的FTO抑制则可使伊布替尼引起的DNA损伤进一步增加。 6.体内实验中，FB23-2与伊布替尼在CLL小鼠中表现出强效的协同作用。相比于伊布替尼单药组，两药联用组小鼠生存期延长，肿瘤负荷降低，骨髓及脾脏中CLL细胞比例减少，脾肿大程度减弱，脾脏组织Ki67表达水平下降。 研究结论 FTO在CLL患者表达升高，且FTO高表达的患者往往治疗效果不佳、预后不良。FTO靶向抑制剂FB23-2能够通过抑制CLL细胞的增殖，增加细胞凋亡，介导细胞G1/S期阻滞等生物学过程抑制CLL的发生发展。此外，FTO介导CtBP1mRNA的m6A去甲基化修饰，增加其RNA稳定性进而促进CtBP1表达。抑制FTO可通过影响CtBP1介导的DNA损伤应答通路，增强CLL细胞对伊布替尼的药物敏感性。FB23-2与伊布替尼联用在体内及体外均表现出显著的协同作用。这些研究结果为FTO在CLL中的应用提供了临床前证据，提示了FB23-2联合伊布替尼治疗CLL的临床转化潜力。
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