摘要
目的:雄黄(Realgar)是一种含有类金属砷的传统中药，临床应用广泛。一些经典名方如安宫牛黄丸、牛黄解毒片等均含有雄黄。但由于受到中药无毒副作用传统观念的影响，未能科学合理的使用单味雄黄或其复方制剂引起的药源性砷中毒事件时有报道。流行病学和动物实验表明长期砷暴露不仅可以引起皮肤损伤、消化系统损伤和癌症发生，严重者还可引起中枢神经系统损伤。因此，由雄黄入药引发的砷暴露和累积效应对人体健康的影响已引起公众的广泛关注，而脑是砷的毒性靶器官之一，所以，探讨雄黄的中枢神经系统毒性作用机制，发现其毒性早期改变的敏感分子靶点，对于早期采取有效措施防制药源性砷中毒的发生、指导临床合理用药具有重要的理论和现实意义。 自噬作为一种重要的机体自我调节机制，参与生长发育和细胞分化、抵御病原体等多种生物学功能。神经细胞自噬过程紊乱会导致蛋白聚集物的积累，破环细胞稳态，产生神经毒性。经典的自噬过程可以分为3个阶段:自噬诱导阶段、自噬体形成阶段和自噬溶酶体降解阶段，任何一个阶段的损伤均会导致细胞稳态失衡。课题组前期结果显示，p62/SQSTM1(Sequestosome1)作为自噬降解的标志性蛋白，其表达水平在雄黄暴露后的动物脑中显著增加。研究表明，自噬诱导增强，神经元中大量p62被招募到自噬体，随后在溶酶体内降解，当p62无法降解，在自噬体内积累后可通过激活caspase-8炎症级联反应和增加caspase-9的裂解诱导神经细胞凋亡。提示雄黄可能通过激活自噬诱导阶段和/或抑制自噬降解阶段导致p62积累，从而产生神经毒性。 其中，JNK/Vps34复合物途径在调控自噬诱导过程中发挥重要作用。当细胞因子、应激、炎症因子等因素激活JNK/c-Jun信号通路后，Beclin1表达上调，Beclin1-Vps34复合物形成增加，自噬诱导被激活，LC3水解为LC3Ⅰ，随后LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ，募集p62,结合到自噬体膜上，形成自噬体，然后在溶酶体组织蛋白水解酶以及溶酶体的酸性环境共同作用下被降解。在自噬被过度激活后，自噬的高效降解则对维持细胞存活至关重要。目前对于雄黄是否通过JNK信号通路介导Beclin1-Vps34复合物途径激活自噬促进p62聚集尚未阐明。 此外，前期研究证明，雄黄可激活皮质中核因子E2相关因子2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2,NRF2)，一个参与抗凋亡和抗氧化防御的关键转录因子。值得注意的是，NRF2活化后可直接诱导p62转录并促进p62蛋白的表达，p62又可与NRF2竞争结合KEAP1,促使NRF2活化，由此形成p62-NRF2反馈回路。然而，p62-NRF2反馈回路的变化在雄黄诱导p62积累导致神经毒性中的作用鲜有报道。 线粒体是高度动态的细胞器，在能量代谢，细胞凋亡，细胞自噬，细胞衰老及细胞增殖等生物学过程中扮演着重要角色。线粒体功能障碍与神经损伤密切相关。我们发现雄黄暴露后，皮质神经元中线粒体受到的损害较为严重，那么，在雄黄诱导的中枢神经系统毒性中，线粒体扮演着何种角色，尚未有研究报道。线粒体持续的进行融合和分裂，进而调控线粒体的形态、数量、分布和功能，融合较少或分裂增多导致的线粒体破碎会触发线粒体凋亡途径。越来越多的证据表明在神经、肝脏以及癌症疾病中，DRP1被招募到线粒体膜上后介导线粒体过度分裂促进了细胞凋亡并激活了线粒体自噬，然而，一方面DRP1受到哪些受体蛋白的招募，仍有很大的探索空间;另一方面线粒体自噬作为维持细胞稳态的一把双刃剑，在雄黄破坏线粒体动力学促进细胞凋亡中的作用及其机制也尚未被阐明。 综上所述，本研究采用整体动物和细胞实验相结合的方法，分别从“自噬流与p62-NRF2反馈回路交互对话介导p62积累”，以及UBXD8-DRP1介导线粒体分裂和PINK1-Parkin调控线粒体自噬交互对话的角度，探讨雄黄诱导的中枢神经系统毒性作用机制，以期为雄黄的毒性机制的研究提供研究基础和新的实验数据。 方法:1、构建不同剂量雄黄暴露的大鼠模型选择3周龄、雌性SpragueDawley大鼠30只，按照随机数表法分为:对照组、0.3g/kg和0.9g/kg雄黄组，每组各10只。雄黄暴露8周后，采用新事物识别实验和旷场实验评估大鼠的认知能力、情绪状态和运动能力的变化;采用液相色谱-原子荧光联用仪(LC-AFS)检测尿液、血液和大脑皮质中砷的各种形态砷含量;采用AFS检测血液和大脑皮质中总砷含量;采用分子生物学技术如透射电子显微镜、免疫荧光、免疫印迹、TUNEL染色法等研究雄黄暴露后对中枢神经系统的损伤。2、构建雄黄暴露后JNK抑制剂干预大鼠模型选择3周龄、雌性SpragueDawley大鼠24只，按照随机数表法分为:对照组、0.9g/kg雄黄组、JNK抑制剂干预组(SP组)、SP+0.9g/kg雄黄染毒组，每组各6只。处理动物8周后，采用分子生物学技术如免疫印迹法等研究雄黄激活自噬的分子机制。3、在第一部分使用雄黄代谢终产物DMA处理SH-SY5Y细胞，建立体外雄黄暴露模型不同浓度的DMA(0、2.5、5、10mM)处理SH-SY5Y细胞不同时间或24h。采用流式细胞仪法检测细胞凋亡率;采用透射电子显微镜观察细胞自噬体形成;采用分子生物学技术如免疫印迹法检测自噬相关蛋白和NRF2蛋白表达水平;采用试剂盒法，检测组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的水解活性。4、分别使用小分子化合物SP600125抑制JNK信号通路，小RNA干扰p62和NRF2的表达，建立不同干预模型，采用分子生物学技术如免疫印迹和qPCR法检测自噬相关蛋白和NRF2蛋白;5、在第二部分选择iAs3+(0、5、10、20μM)处理PC12细胞系作为雄黄暴露的体外模型，分别使用小分子化合物Mdivi-1抑制线粒体分裂，小RNA干扰UBXD8和PINK1的表达，建立不同干预模型，采用分子生物学技术如免疫印迹检测线粒体动力学相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白和线粒体凋亡相关蛋白的表达，采用免疫荧光检测线粒体形态、UBXD8与DRP1的共定位情况。 结果:1、雄黄暴露后大鼠大脑皮质、血液和尿液中形态砷的水平LC-AFS结果显示，雄黄暴露后在尿液中检测到iAs、DMA和MMA,而在血液中仅检测到DMA,脑组织中进行蓄积的砷也主要以DMA的形态存在，提示雄黄在脑中的代谢终产物是DMA。2、雄黄对大鼠神经行为学的影响新事物识别实验结果显示，在测试阶段，与对照组相比，0.3g/kg和0.9g/kg雄黄暴露组大鼠对新事物和旧事物没有表现出明显的偏好，表明雄黄导致大鼠认知障碍。旷场实验结果显示，与对照组相比，雄黄暴露组大鼠进入中心区域的次数和在中心区域停留的时间以及运动距离和运动速度均显著下降，且呈明显的剂量-效应关系，表明雄黄诱导大鼠产生类似焦虑的行为并损伤了运动能力。3、雄黄对神经元超微结构和凋亡的影响雄黄可诱导大鼠皮质神经元超微结构(线粒体、内质网和高尔基体)损伤、细胞凋亡发生。4、雄黄扰动自噬流稳态介导p62促进细胞凋亡结果显示，雄黄诱导自噬流稳态失衡，表现为LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高，自噬体增多，p62蛋白表达显著升高，沉默p62后，细胞凋亡减轻。5、雄黄通过JNK/Vps34复合物途径激活自噬诱导过程促进p62聚集结果显示，雄黄暴露后可激活JNK信号通路和自噬诱导相关蛋白Beclin1和Vps34的表达，加强Beclin-Vps34复合物的结合能力，在抑制JNK信号通路后，自噬发生相关蛋白Beclin1、Vps34和LC3Ⅱ蛋白表达下降，Beclin1-Vps34复合物的结合能力也显著下降，p62蛋白表达没有显著变化。6、雄黄通过抑制溶酶体水解酶活性使自噬降解过程受阻结果显示，雄黄暴露后，溶酶体水解酶B(CTSB)和溶酶体水解酶D(CTSD)活性显著下降，DMA处理后，SH-SY5Y细胞中观察到自噬体和溶酶体的融合过程未受影响，但酸性环境降低。7、雄黄激活p62-NRF2反馈回路促进p62的积累结果显示，雄黄暴露后皮质神经元内ROS水平显著升高，NRF2蛋白表达水平显著升高，体外实验结果表明DMA处理后，p62-NRF2的结合能力降低，沉默p62后，NRF2的活化受到抑制，这说明NRF2以p62依赖的方式活化，增强了p62-NRF2反馈回路，有助于自噬流紊乱诱导的p62积累。8、雄黄对血液和大脑皮质中总砷水平的影响结果显示，血液中的总砷含量显著升高，但不具有剂量依赖性,皮质中总砷含量呈剂量依赖性显著升高。9、雄黄诱导大鼠大脑皮质线粒体功能障碍并触发线粒体凋亡途径结果显示，雄黄暴露后，线粒体电子呼吸链复合物ETC下降，ATP下降，同时Cyt-c和caspase-3蛋白表达水平显著升高。10、雄黄抑制线粒体融合并通过UBXD8-DRP1途径调控线粒体分裂促进凋亡结果显示，雄黄暴露后下调了融合蛋白OPA1和MFN1的表达，上调分裂蛋白DRP1以及线粒体膜蛋白UBXD8的表达，沉默UBXD8后，UBXD8与DRP1共定位减少，线粒体分裂减轻，使用Mdivi-1抑制线粒体分裂后，线粒体凋亡蛋白表达水平显著下降。11、线粒体分裂参与雄黄诱导的线粒体自噬发生结果显示，雄黄暴露后，线粒体自噬诱导相关蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62蛋白表达显著升高，采用Mdivi-1抑制线粒体分裂后，PINK1和LC3共定位减少，PINK1和Parkin蛋白表达显著下降。12、PINK1-Parkin介导的线粒体自噬调控砷诱导的线粒体分裂及凋亡结果显示，沉默PINK1抑制自噬诱导后，线粒体分裂受到抑制，细胞凋亡情况得到缓解。 结论:1、雄黄暴露诱导神经细胞凋亡导致大鼠认知障碍、情绪改变和运动能力下降。2、雄黄通过JNK/Vps34复合物途径激活自噬诱导阶段并大量募集p62，同时直接抑制溶酶体功能而非自噬溶酶体融合过程，阻碍p62降解，进而促进p62积累参与神经细胞凋亡。3、p62-NRF2反馈回路增强也对p62积累起到了促进作用。4、雄黄抑制线粒体融合并通过UBXD8-DRP1途径促进线粒体过度分裂导致线粒体动力学失衡，线粒体功能障碍，诱导细胞凋亡，同时激活PINK1/Parkin途径调控线粒体自噬。
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