摘要
目的:初步建立3-脱氧果糖(3-Deoxyfructose,3-DF)的高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)，建立体外直接结合和干预3-DG还原酶酶促反应清除3-脱氧葡萄糖醛酮(3-Deoxyglucosone，3-DG)的中药筛选体系，筛选有效用的方剂或成分，构建清除3-DG中药方剂-活性成分的关系链。 方法:1、使用GC-MS(GasChromatography-massSpectrometry)对3-DF样品进行鉴定;薄层色谱TLC-HPLC联用对3-DF衍生物峰进行定位;应用2,4-二硝基苯肼柱前衍生，对衍生条件进行考察;采用C18反相色谱柱，流动相为乙腈-水(10％:90％～90％:10％)梯度洗脱60min,紫外检测波长352nm,进行方法学考察。2、建立3-DG体外直接结合清除反应体系:取3-DG在生理条件下孵育，在0、1.5、24h时取样本，检测3-DG的含量变化。考察其变异系数，并应用阳性药(氨基胍)考察方法的可靠性;3、建立3-DG体外还原酶酶促反应体系:对提取的鸡肝脏3-DG还原酶进行鉴定，检测酶促反应中辅酶NADPH消耗量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定所提取酶蛋白的分子量;取3-DG-3-DF溶液、NADPH、3-DG还原酶冻干粉混合在生理条件下孵育，在0、1.5h时取样本，检测3-DG、3-DF的含量变化，考察其变异系数;4、取3-DG与药物在生理条件下孵育，在0、1.5、24h时取样本，检测3-DG的含量变化;取3-DG-3-DF溶液、NADPH、3-DG还原酶冻干粉、药物混合在生理条件下孵育，在0、1.5h时取样本，检测3-DG、3-DF的含量变化;5、建立黄芩-黄连水煎液主要活性成分的高效液相色谱图;黄芩-黄连与3-DG在生理条件下孵育，检测活性成分峰的变化;将含量显著减少的活性成分与3-DG在生理条件下孵育，用3-DG的HPLC方法检测含量变化。 结果:1、鉴定合成样品含3-DF;初步建立3-DF的HPLC检测方法:3-DF衍生物峰呈尖峰，分离度良好;衍生条件考察结果表明衍生液中1∶3添加乙酸乙酯、4℃放置效果最佳;方法标准曲线方程为y=194.88x-12.267,R2=0.9996,线性关系良好;精密度RSD为2.4％，重复性RSD为4.4％,稳定性RSD为2.4％;2、3-DG体外直接结合反应体系三个反应时间点的3-DG检测值的相对标准偏差小于10％;与氨基胍组即时的3-DG含量相比，氨基胍与3-DG体外生理条件下共孵育1.5、24h后，3-DG含量均显著下降(P＜0.05,P＜0.001);3、反应组剩余NADPH的OD值低于对照组(P＜0.05，P＜0.001);电泳结果显示鸡肝脏酶液具有49kDa区带;3-DG还原酶酶促反应体系中，反应组孵育0、1.5h时，3-DG、3-DF检测值的相对标准偏差均小于10％;与对照组相比，3-DG与还原酶、辅酶共孵育1.5h后，3-DG含量显著下降，3-DF含量显著上升，3-DG消耗量与3-DF增加量均显著增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）;4、3-DG体外直接结合反应中，与即时的3-DG含量相比，二甲双胍、EGCG、半夏泻心汤苦降方（黄芩-黄连）、辛开苦降方（半夏-干姜-黄芩-黄连）、葛根芩连汤、三黄胶囊、补肾化痰活血方、滋肾丸与3-DG生理条件下孵育1.5h后3-DG含量无变化，孵育24h后3-DG含量显著减少（P＜0.05,P＜0.01，P＜0.001）;半夏泻心汤去甘草方、半夏-黄连方与3-DG孵育后，3-DG含量有减少的趋势;姜黄素、芹菜素、半夏泻心汤、六君子汤与3-DG孵育后，3-DG含量无变化;5、在3-DG体外还原酶酶促反应中，与反应组相比，补肾化痰活血方组3-DG消耗量减少，3-DF增加量减少;黄芩-黄连组、三黄胶囊组与3-DG孵育后，3-DG消耗量减少，3-DF增加量未影响（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）;6、黄芩-黄连药对水煎液的主要活性成分有:黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素;3-DG体外直接结合反应中，黄芩-黄连与3-DG孵育1.5h后黄芩素含量减少，孵育24h后黄芩苷、黄芩素含量减少（P＜0.05，P＜0.01）;黄芩苷与3-DG孵育1.5h后3-DG含量无明显改变，孵育24h后3-DG显著减少;黄芩素与3-DG孵育1.5h后3-DG含量增加，孵育24h后3-DG含量显著减少（P＜0.05,P＜0.01）。 结论:建立了3-DF的HPLC初步检测方法;建立了3-DG体外直接结合反应体系，以3-DG的消耗反映药物的清除3-DG作用;建立了3-DG体外还原酶酶促反应体系，以3-DG的消耗和3-DF的生成反映药物的对3-DG酶促反应的影响;二甲双胍、EGCG、半夏泻心汤苦降方（黄芩-黄连）、辛开苦降方（半夏-干姜-黄芩-黄连）、葛根芩连汤、三黄胶囊、补肾化痰活血方、滋肾丸对3-DG有直接结合清除的作用，半夏泻心汤去甘草方、半夏-黄连方对3-DG有直接结合清除的趋势，姜黄素、芹菜素、半夏泻心汤、六君子汤对3-DG无清除作用;补肾化痰活血方抑制3-DG还原酶酶促反应，黄芩-黄连、三黄胶囊对3-DG还原酶酶促反应无影响;黄芩-黄连中直接清除3-DG的活性成分为黄芩苷、黄连素。本文为3-DG还原酶酶促反应相关研究提供基础支持，为中药防治糖尿病前期的途径、活性成分提供探究方向，为糖尿病领域研究提供帮助。
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