摘要
乳腺癌是“世界第一大癌症”，其发病率逐年增长。三阴性乳腺癌（Triple-negativebreastcancer,TNBC）占所有乳腺癌亚型的15％至20％,是恶性程度和侵袭性最高的亚型。TNBC的特点是缺乏雌激素受体（EstrogenReceptor,ER）、孕激素受体（Progesteronereceptor,PR）和人表皮生长因子受体2型（Humanepidermalgrowthfactorreceptortype2,HER-2）的表达。与激素受体阳性和HER-2阳性亚型的乳腺癌不同，TNBC缺乏临床生物标志物和治疗策略。因此，筛选新的治疗靶点以改善TNBC患者的预后是迫切且必要的。环状RNA（circularRNA,circRNA）在TNBC组织中失调，并且与TNBC患者的临床病理特征和预后相关。此外，寻找具有高特异性和敏感性的circRNA将为TNBC的早期诊断、临床治疗和预后监测提供新的机遇。 为了识别和表征参与TNBC进展的功能性circRNA,本研究利用TNBC相关的转录组数据库结合132例TNBC临床样本分析表明，主要定位于细胞质中的环状的巨噬细胞加帽蛋白（circularMacrophage-cappingprotein,circCAPG）hsa_circ_0055412在TNBC细胞和组织中的表达上调，较高表达水平的circCAPG与TNBC患者较差的预后相关。生存曲线分析和受试者工作特征曲线分析表明，circCAPG具有作为判断TNBC预后的潜力。circCAPG对TNBC细胞增殖、迁移和侵袭至关重要，敲降circCAPG可以在体内和体外抑制TNBC的恶性进展。根据在线数据库circRNADb的预测，结合双荧光素酶和液相色谱-质谱实验的结果，circCAPG可以翻译成一个具有171个氨基酸的多肽，本研究将这个多肽命名为CAPG-171aa。细胞表型实验证明CAPG-171aa可以在体内和体外促进TNBC的恶性进展。将多肽CAPG-171aa回补至敲降circCAPG的TNBC细胞中，可以完全回补敲降circCAPG引起的表型，这表明circCAPG通过翻译的多肽CAPG-171aa在TNBC中发挥作用，与circCAPG的其他功能无关。 通过液相色谱-质谱实验和免疫共沉淀实验证明，在TNBC细胞中丝氨酸/苏氨酸激酶38（Serine/threoninekinase38,STK38）与CAPG-171aa结合，而不与母源蛋白巨噬细胞加帽蛋白（Macrophage-cappingprotein,CAPG）结合。STK38的蛋白水平在TNBC中下降，过表达STK38显著抑制TNBC细胞的恶性进展。进一步的研究表明，过表达CAPG-171aa导致STK38与SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1（SMADspecificE3ubiquitinproteinligase1,SMURF1）的结合减少，进而导致丝裂原激活蛋白激酶激酶2（Mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase2,MEKK2）泛素化减弱和MEKK2蛋白的积累。相同的，circCAPG消耗导致MEKK2泛素化增加和MEKK2蛋白水平降低。放线菌酮（Cycloheximide,CHX）抑制实验证明，敲降circCAPG导致MEKK2蛋白质降解加快。MEKK2蛋白的减少通过抑制下游丝裂原激活蛋白激酶激酶1/2（Mitogen-activatedproteinkinasekinase1/2,MEK1/2）-细胞外信号调节激酶1/2（Extracellularsignal-regulatedkinase1/2,ERK1/2）信号通路抑制TNBC的恶性进展，这表明MEKK2蛋白是CAPG-171aa的重要下游蛋白。通过在过表达CAPG-171aa的TNBC细胞中敲降MEKK2进一步证明，MEKK2蛋白的减少可以抑制过表达CAPG-171aa引起的TNBC恶性进展，这表明CAPG-171aa通过激活下游的MEKK2信号通路在TNBC中发挥作用。 侧翼内含子互补序列和RBP（RNAbindingprotein,RBP）对于circRNA的生成至关重要。之前的研究表明，103种RBP在circRNA生成中可能发挥作用。本研究利用TCGA数据库结合实验验证发现，8个RBP在TNBC中失调。通过过表达和敲降实验证实，SLU7（SLU7-Homologsplicingfactor,SLU7）与circCAPG的形成可能相关。通过132例TNBC患者组织中SLU7与circCAPG表达水平的相关性分析，进一步证实SLU7与circCAPG呈负相关。RIP-qPCR（RNAimmunoprecipitationqPCR,RIP-qPCR）实验证实，SLU7通过结合circCAPG前体mRNA的上下游侧翼序列Alu（AluArthrobacterluteus,Alu）调控circCAPG的生成。之后，将任意一或两个Alu序列引入CAPG外显子6-8的上下游来创建不同的小基因构建体，结果证实CAPG外显子6-8上下游的Alu对于circCAPG的形成必不可少。 综上所述，SLU7介导circCAPG通过编码新型多肽CAPG-171aa并激活MEKK2-MEK1/2-ERK1/2通路促进TNBC的恶性进展。新发现的编码circRNA-circCAPG拓宽了我们对编码circRNA在TNBC中的认识，并且能够为临床治疗TNBC提供潜在的治疗靶点。
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