摘要
背景:动脉粥样硬化是威胁人类健康的主要因素之一，可引起冠状动脉、脑动脉以及外周动脉病变，导致多种缺血性疾病影响生活质量并危及生命，给社会造成巨大的医疗负担。近年来，科学家们发现血液流体剪切力对动脉粥样硬化有非常重要的作用。 既往研究发现，血流速度越快及血流剪切力越高，颈总动脉的内膜-中膜厚度越小。运动康复增加血液流速和血流剪切力，可以减轻动脉粥样硬化，改善血管健康状态及冠心病患者的预后。此外，在临床和解剖工作中发现，严重的动脉粥样斑块多出现于血流剪切力较低的血管弯曲及分叉部位，而在血流剪切力较高的平直大中动脉很少出现，这里的剪切力数值一般在15dyn/cm2以上，被认为具有抑制动脉粥样硬化的作用。目前有一些关于高流体剪切力保护血管壁和抑制脉粥样硬化发展的作用机制相关研究，但对于高流体剪切力是否能够通过影响斑块中巨噬细胞的表型逆转动脉粥样硬化目前尚无报道。本实验中我们选择20dyn/cm2作为高剪切力作用强度，验证高剪切力是否通过内皮细胞影响巨噬细胞表型，从而干预动脉粥样硬化的进展。 巨噬细胞表型对动脉粥样硬化的影响也是近年来的研究热点，巨噬细胞不同表型（即M1和M2）对炎症及动脉粥样斑块发展有着几乎相反的作用。M1型巨噬细胞促进炎症反应、加剧动脉粥样硬化;M2型巨噬细胞对抗炎症、减轻动脉粥样硬化，促进细胞和血管再生。因此在动脉粥样硬化斑块中，鉴定侵入内皮下巨噬细胞的表型有重要研究价值。 血管内皮细胞能够感知血管腔内流体剪切力变化，分泌多种因子及物质，以此影响其临近细胞生理功能，包括侵入血管壁内的巨噬细胞。有多项关于糖尿病及肿瘤的研究显示，内皮细胞影响巨噬细胞极化，根据微环境不同，内皮细胞可以诱导巨噬细胞分别向有利于炎症的M1或血管生成的M2表型分化。在动脉粥样硬化斑块中，内皮细胞与侵入动脉壁内的巨噬细胞位置相邻，内皮细胞是否也可以调控巨噬细胞表型将在本研究中验证。 流体剪切力可以作用于血管腔内皮细胞，却无法直接作用于侵入血管内皮下的巨噬细胞。本试验旨在研究剪切力是否可以通过内皮细胞影响动脉斑块内巨噬细胞表型及其中机制。我们从流体力学、细胞间通讯和巨噬细胞极化角度对动脉粥样硬化的转归进行研究，为临床动脉粥样硬化性疾病的预防和治疗提供新视野。 方法: 1.建立内皮细胞、巨噬细胞共培养系统，在静态和高剪切力条件下分别观察并对比巨噬细胞表型状态。Westernblot方法检测Arg-1,iNOS的蛋白表达水平;qRT-PCR方法检测Arg-1,Mrc-1,IL-10,IL-1β，IL-6,iNOS,TNF-α的mRNA表达水平;ELISA方法检测共培养系统上层巨噬细胞培养基中IL-10,IL-1β,IL-6,TNF-α的表达水平;免疫荧光染色方法观察M1特异性抗体CD86及M2特异性抗体CD163的荧光显色情况。 2.在transwell小室中建立巨噬细胞单培养系统及内皮细胞、巨噬细胞共培养系统，在高剪切力条件下分别观察并对比巨噬细胞表型状态。Westernblot方法检测Arg-1的蛋白表达水平;qRT-PCR方法检测Arg-1，Mrc-1，IL-10的mRNA表达水平;ELISA方法检测transwell小室上层巨噬细胞培养基中IL-10的表达水平;免疫荧光染色方法观察M2特异性抗体CD163的荧光显色情况。 3.构建动脉粥样硬化小鼠单侧颈动脉完全结扎模型，Westernblot方法和qRT-PCR方法对比两侧颈动脉中Arg-1蛋白表达水平和Arg-1，CD163的mRNA表达水平;免疫荧光染色方法观察两侧颈总动脉中M2型巨噬细胞(CD163+CD68+)荧光发光情况。 4.内皮细胞分别经静态和高剪切力作用后，用qRT-PCR方法检测内皮细胞中IL-1β，IL-6,IL-10,TNF-α的mRNA表达水平;用ELISA方法检测内皮细胞培养基中IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α分泌情况。分别经静态和高剪切力作用后，对比内皮细胞中PPARγ表达水平，Westernblot方法检测PPARγ蛋白表达水平，qRT-PCR方法检测PPARγ的mRNA表达水平。 5.对高剪切力条件下的内皮细胞进行PPARγsiRNA转染，转染ScrambleRNA作为对照组，对比内皮细胞分泌因子情况。用qRT-PCR方法检测内皮细胞中IL-1β,IL-6，IL-10，TNF-α的mRNA表达水平;用ELISA方法检测内皮细胞培养基中IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α分泌情况。 6.高剪切力处理下的共培养系统中，对巨噬细胞进行IL-6RsiRNA转染，转染ScrambleRNA作为对照组，对比巨噬细胞表型状态。Westernblot方法检测Arg-1蛋白表达水平;qRT-PCR方法检测Arg-1,Mrc-1,IL-10的mRNA表达水平;ELISA方法检测共培养系统上层巨噬细胞培养基中IL-10表达水平;免疫荧光染色方法观察M2特异性抗体CD163的荧光显色情况。 7高剪切力处理下的共培养系统中，对巨噬细胞进行IL-6RsiRNA转染，转染ScrambleRNA作为对照组，对比PI3K/Akt通路因子表达。Westernblot方法检测PI3K,Akt蛋白表达水平，qRT-PCR方法检测PI3K,Akt的mRNA表达水平。 8.高剪切力处理下的共培养系统中，对上层巨噬细胞进行PI3K抑制，等体积生理盐水处理作为对照组，对比巨噬细胞表型状态。Westernblot方法检测Arg-1蛋白表达水平;qRT-PCR方法检测Arg-1,Mrc-1,IL-10的mRNA表达水平;ELISA方法检测共培养系统上层巨噬细胞培养基中IL-10表达水平;免疫荧光染色方法观察M2特异性抗体CD163的荧光显色情况。 9.数据分析:每项细胞实验均进行3次重复独立实验。所有定量结果以均数±标准差表示。使用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，两组之间数值比较采用独立样本T检验分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。实验作图采用GraphPadPrism8.0软件绘制。 结果: 1.用Westernblot方法检测巨噬细胞表型蛋白，结果显示:相较于静态系统，高剪切力可以显著升高共培养系统中M2型巨噬细胞特异蛋白（Arg-1）及PI3K,Akt蛋白表达（Arg-1:p＜0.05;PI3K:p＜0.01;Akt:p＜0.05）。RT-PCR结果显示高剪切力组M2型巨噬细胞相关因子（Arg-1，IL-10）及PI3K,Akt的mRNA表达高于静态对照组（p＜0.05）。ELISA检测结果显示高剪切力组共培养系统上层巨噬细胞分泌IL-10高于对照组，差异具有统计学意义（p＜0.05）。免疫荧光染色显示，高剪切力条件下共培养系统中巨噬细胞CD163荧光发光明显强于静态组。 2.RT-PCR及Westernblot结果显示:高剪切力条件下，相较于巨噬细胞单培养系统，内皮细胞和巨噬细胞共培养系统中，巨噬细胞M2型特征因子Arg-1,IL-10的mRNA水平及M2型特征蛋白Arg-1表达水平较高（p＜0.05）。ELISA检测结果显示共培养系统中巨噬细胞分泌IL-10高于单培养系统（p＜0.05）。免疫荧光染色显示，共培养系统中巨噬细胞CD163荧光发光强于单培养系统。 3.RT-PCR及Westernblot结果显示:小鼠未结扎侧颈总动脉中M2特异性因子Arg-1和CD163的mRNA水平及特征蛋白Arg-1水平高于完全结扎侧（p＜0.05）。免疫荧光染色显示，小鼠未结扎侧颈总动脉中M2型巨噬细胞（CD163+CD68+）荧光发光强于完全结扎侧（p＜0.05）。 4.用RT-PCR方法测定C166中各因子mRNA表达情况，结果显示:相较于静态系统，高剪切力作用下C166中IL-6,IL-10及PPARγ的mRNA表达水平高于静态对照组（IL-6:p＜0.01;IL-10:p＜0.05;PPARγ:p＜0.05）。用ELISA方法检测C166分泌因子情况，结果显示:相较于静态系统，高剪切力条件下C166分泌IL-6增多（p＜0.05）。Westernblot方法检测到，高剪切力条件下内皮细胞中PPARγ蛋白表达水平高于静态组（p＜0.05）。 5.对高剪切力条件下内皮细胞进行PPARγ基因敲降处理，PPARγ敲降后，RT-PCR结果显示C166中IL-6的mRNA表达水平下降（p＜0.05），ELISA结果显示其培养基中IL-6含量减少（p＜0.05）。 6.对高剪切力条件下共培养系统中巨噬细胞进行IL-6R基因敲降处理，IL-6R敲降后,Westernblot结果显示巨噬细胞Arg-1蛋白表达水平降低（p＜0.05）,qRT-PCR结果显示其Arg-1,IL-10的mRNA表达水平降低（p＜0.05），ELISA结果显示上层巨噬细胞培养基中IL-10表达量下降（p＜0.05），巨噬细胞免疫荧光染色显示CD163荧光发光减弱。 7.高剪切力条件下共培养系统中巨噬细胞IL-6R基因敲降后，Westernblot结果显示巨噬细胞中PI3K,Akt蛋白表达水平下降（p＜0.05），qRT-PCR结果显示巨噬细胞中PI3K,Akt的mRNA表达水平下降（p＜0.05）。 8.高剪切力条件下共培养系统中，对上层巨噬细胞进行PI3K抑制后，巨噬细胞中Arg-1的蛋白表达水平下降（p＜0.05）,Arg-1,Mrc-1的mRNA表达水平均下降（p＜0.05），共培养系统上层巨噬细胞培养基中IL-10水平下降（p＜0.05），免疫荧光染色显示CD163荧光发光减弱。 结论: 1、高剪切力条件下内皮细胞促使巨噬细胞向M2极化 2、高剪切力通过诱导PPARγ高表达促进内皮细胞分泌IL-6 3、高剪切力通过促进内皮细胞分泌IL-6使其临近巨噬细胞向M2型极化 4、高剪切力条件下内皮细胞分泌的IL-6通过PI3K/Akt信号通路促使其临近巨噬细胞向M2型极化。
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