摘要
目的: 应用黄芪-莪术（AC）配伍，调控上皮-间质转化（EMT）对结肠癌HT-29细胞及异位HT-29皮下移植瘤裸鼠进行药效评价;基于抗血管生成，探讨莪术有效成分莪术醇作用于异位CT-26结肠癌皮下移植瘤小鼠的机理研究，为临床上益气活血类中药应用于结肠癌提供新的理论依据。 研究方法: （1）使用人结肠啊HT-29细胞进行体外实验研究，采用噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞存活和生长，EDU（5-溴-2-脱氧尿嘧啶）细胞增殖实验和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力，流式细胞术检测细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹（Westernblot）检测黄芪-莪术作用后HT-29细胞中Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3相关凋亡蛋白和E-cadherin、MMP9、MMP2、vimentin相关EMT蛋白的表达水平。此外建立HT-29结肠癌皮下移植瘤模型，治疗后观察记录瘤体的体积与质量，对瘤组织进行HE染色，蛋白免疫印迹（Westernblot）检测黄芪-莪术作用后裸鼠瘤组织中Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3相关凋亡蛋白和E-cadherin、MMP9、MMP2、vimentin相关EMT蛋白的表达水平。 （2）通过TCGA数据库发现IGF2BP3在结肠癌中的表达，以及结肠癌各病理阶段IGF2BP3mRNA的表达情况;癌症总生存期（OS）采用Kaplan-Meier进行分析;应用分子对接对莪术醇和IGF2BP3的分子结合能进行研究，DiscoveryStudio2021Client软件进行可视化。 （3）建立CT-26结肠癌皮下移植瘤模型，治疗后观察记录瘤体的体积与质量，对瘤组织进行HE染色，取瘤组织进行免疫荧光检测肿瘤增殖标记物Ki67、血管生成标志物CD31以及IGF2BP3的表达，采用流式细胞术检测瘤组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及调节性T细胞的浸润情况，TUNEL荧光染色检测瘤组织的细胞凋亡以及Westernblot检测小鼠瘤组织中Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3相关凋亡蛋白的表达。通过细胞转染构建IG2BP3过表达CT-26细胞株，Westernblot进行细胞转染验证，建立异位移植瘤模型，取瘤体组织对血管形成标志物CD31进行免疫荧光检测。 结果: 1.MTT结果显示给药组明显抑制HT-29结肠癌细胞和HCT-116结肠癌细胞的活性（P＜0.01）;AC对HIEC的活性无明显影响;EDU实验结果显示，给药组中处于增殖期的细胞数量明显降低（P＜0.01）;Transwell实验显示，AC显著抑制HT-29结肠癌细胞侵袭和迁移（P＜0.01）。提示AC可体外抑制结肠癌HT-29细胞的增殖、迁移和侵袭。 2.流式细胞术结果显示，给药组中HT-29细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）;各给药组中GO/G1期细胞显著增加，S期细胞显著减少（P＜0.01）;黄芪-莪术中剂量和黄芪-莪术高剂量组G2/M期细胞显著增加;Westernblot分析中，黄芪-莪术明显抑制Bcl2蛋白的表达，促进Bax、caspase-3、cleavedcaspase-3蛋白的表达（P＜0.01）。提示AC可体外诱导结肠癌HT-29细胞的凋亡。 3.Westernblot实验结果显示，黄芪-莪术能够显著下调HT-29细胞MMP9、MMP2、vimentin蛋白表达水平，而显著上调E-cadherin蛋白表达水平（P＜0.01）。提示AC可体外改善结肠癌HT-29细胞的上皮-间质转化。 4.黄芪-莪术给药后皮下瘤的体积与肿瘤重量均显著减轻，Westernblot实验检测凋亡和EMT相关蛋白的表达与体外实验一致。且HE染色结果显示给药组中，细胞体积明显缩小，细胞核固缩，细胞间隙变大，胞质紧密。提示AC抑制裸鼠HT-29细胞皮下瘤的生长，改善体内结肠癌细胞的上皮-间质转化。 5.基于TCGA数据库分析发现IGF2BP3在结肠癌中表达升高，且IGF2BP3的表达与结肠癌患者低生存期和病例阶段相关。提示IGF2BP3在结肠癌中被激活，且与结肠癌生存期相关。 6.人源IGF2BP3（IMP3）和莪术醇单体进行分子对接，结果显示两者有较强的的结合能（-5.28kcal/mol）。 7.实验过程中，正常小鼠荷瘤后出现厌食现象（即恶病质），体重减轻;治疗后，给药组显著抑制结肠癌在体内的生长，移植瘤瘤重及瘤体积明显降低（P＜0.01）。免疫荧光检测Ki67的表达显著低于空白对照组（P＜0.01）;TUNEL荧光染色，不同浓度的莪术醇可使肿瘤细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）;Westernblot检测结果显示莪术醇可增加CT-26移植瘤细胞促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3表达，而降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达，（P＜0.01）。提示莪术醇能够抑制小鼠CT-26结肠癌皮下移植瘤的生长且诱导结肠癌细胞凋亡。免疫荧光结果显示莪术醇治疗后小鼠瘤体组织中的IGF2BP3的含量逐渐降低，且显示瘤体组织中CD31的表达明显减弱（P＜0.01）。Westernblot检测结果也显示，莪术醇显著降低了瘤体组织中IGF2BP3的表达（P＜0.01）。提示莪术醇下调小鼠CT-26结肠癌皮下移植瘤细胞中的IGF2BP3表达同时抑制血管生成。 8.Westernblot对IGF2BP3细胞转染效果验证，结果显示转染成功（P＜0.01）;莪术醇作用于IGF2BP3过表达移植瘤小鼠后，IGF2BP3过表达明显削弱了莪术醇对CD31的抑制作用（P＜0.01）。提示莪术醇可能通过IGF2BP3抑制结肠癌血管的生成。 9.随着莪术醇给药浓度的升高，CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3-NK1.1+均表现出其表达量显著增加（P＜0.01），而CD4+CD25+Foxp3+的表达量明显降低（P＜0.01）。提示莪术醇可能促进小鼠CT-26结肠癌皮下移植瘤的免疫细胞浸润。 结论: 1.黄芪-莪术能够显著抑制体内外结肠癌HT-29细胞的增殖、侵袭迁移和上皮-间质转化，诱导结肠癌细胞凋亡; 2.IGF2BP3在结肠癌中被激活，且与结肠癌生存期相关; 3.莪术醇能够显著抑制体内结肠癌CT-26细胞的增殖、诱导结肠癌细胞凋亡、促进结肠癌肿瘤免疫细胞的浸润; 4.莪术醇通过下调IGF2BP3抑制结肠癌血管的生成。
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