摘要
目的: 子宫腺肌病(Adenomyosis,AM)是妇科疑难杂症之一，本研究旨在明确玄丹散结汤对子宫在位内膜间充质干细胞(Mesenchymalstemcellsintheeutopicendometrium,eMSCs)增殖的影响，探讨玄丹散结汤治疗AM的机制。 方法: 1.对子宫内膜干细胞分类和标志物表达、AM发生发展的干细胞学说进行归纳,基于Citespace对药物治疗AM研究进展进行可视化分析，为实验研究提供思路。 2.对SD大鼠单次灌胃给药，眼眶取血并分离血清，基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术和对照品比对法鉴定给药后0min、10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h和24h血清药物活性成分并绘制浓度-时间曲线。用玄丹散结汤和生理盐水分别对SD大鼠多次给药，腹主动脉取血并分离含药血清(XuandanSanjiedecoction-containedserum,XSD)和空白血清(Vehicle),用于后续细胞实验。 3.收集AM内膜和正常内膜来源的在位内膜细胞，经消化过滤、SUSD2抗体正性分选获得阳性细胞，利用平板克隆形成实验、体外定向诱导分化和流式细胞术检测表面抗原鉴定eMSCs,构建eMSCs体外培养体系。 4.用体积分数为2.5％的Vehicle和体积分数为2.5％、5％、10％、20％的XSD分别干预AM患者来源的eMSCs(Adenomyosis-derivedeMSCs,A-eMSCs)和正常内膜来源的eMSCs(Normal-derivedeMSCs,N-eMSCs)，CCK-8检测干预后细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，筛选最佳作用浓度，EdU掺入实验检测细胞DNA复制活性，流式细胞术检测eMSCs凋亡。 5.通过mRNA高通量测序挖掘A-eMSCs和N-eMSCs的差异表达基因(Differentialexpressiongene,DEGs)，RT-qPCR验证测序结果，通过GO功能注释分析和KEGG通路富集分析挖掘A-eMSCs异常增殖关键差异基因和信号通路，采用RT-qPCR、Westernblot、细胞免疫荧光检测XSD对关键DEGs和关键信号通路表达的影响。 结果: 1.制得生药浓度为1.95g/mL的浓缩汤剂，从含药血清中鉴定8个活性成分，分别是:丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去甲异波尔定、阿魏酸、槲皮素、山柰酚、柚皮素和姜黄素。 2.纳入11例AM患者和7例内膜正常的其他妇科患者，成功分离eMSCs并构建在位内膜间充质干细胞体外培养体系，eMSCs的SUSD2阳性率达84.6％,在体外形成细胞集落并可被诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞，表达CD73、CD105和CD90,不表达或少表达CD34、CD45和HLA-DR。 3.CCK-8和平板克隆形成实验结果表明XSD浓度依赖性、时间依赖性抑制A-eMSCs和N-eMSCs细胞增殖活性和克隆形成能力，对A-eMSCs抑制作用更强(P＜0.05)，10％体积分数可作为XSD最佳干预浓度。EdU掺入实验结果表明10％XSD抑制A-eMSCsDNA复制活性，流式细胞术结果显示10％XSD对A-eMSCs和N-eMSCs细胞凋亡均无明显影响。 4.测序发现1962个DEGs,其中上调基因882个，下调基因1080个。在差异表达排名前20的DEGs中，XSD显著下调AQP1、MCC、EGR1和LBHmRNA表达水平，上调sFRP4mRNA表达水平(P＜0.01)。KEGG通路富集分析显示sFRP4调控的Wnt通路显著异常表达(P＜0.05)，RT-qPCR和Westernblot结果显示XSD显著上调eMSCs中Wnt通路拮抗剂sFRP4蛋白表达水平，Wnt经典通路关键蛋白β-catenin总水平下调，免疫荧光显示β-catenin入核减少。下游促增殖靶基因CyclinD1、c-Myc和Survivin的mRNA表达和蛋白表达水平显著下调(P＜0.05)。 结论:A-eMSCs增殖能力强于N-eMSCs,玄丹散结汤靶向sFRP4/Wnt/β-catenin信号通路选择性抑制A-eMSCs增殖，是玄丹散结汤治疗AM的潜在关键机制，有待进一步验证。
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