摘要
目的:研究观察薯蓣皂苷元对激光诱发小鼠脉络膜新生血管（CNV）的抑制作用;研究氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）刺激HUVECs细胞后，从宏观的细胞层面和微观的分子层面分别观察其影响，观察对氧化损伤的HUVECs内皮间质转化（EndMT）的作用及其潜在机制，为开发防治AMD的有效中药提供新的思路。 方法:本实验课题首先使用激光处理小鼠的视网膜以建立激光诱导小鼠模型，并使用浓度为50μM和100μM的薯蓣皂苷元溶解于二甲基亚砜（DMSO）溶液对小鼠进行腹膜下注射。对小鼠进行眼底荧光血管造影和光学相干断层成像检查，随后对小鼠RPE/脉络膜进行免疫组化染色处理并拍照分析，以评价薯蓣皂苷元对小鼠脉络膜新生血管形成的影响。采用westernblot定量检测内皮-间质转化中的重要间质标志物蛋白（α-SMA）、内皮标志物蛋白（VE-cadherin）及AKT/GSK-3β通路相关蛋白（TGF-β2、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β）表达水平。细胞实验将HUVECs细胞分为正常组（正常培养）、模型组（ox-LDL作用24小时）、药物组（分别用10μM、20μM、40μM薯蓣皂苷处理）、特别对照组（MK-2206+Ox-LDL作用24小时）。采用细胞计数盒（CCK-8）和流式细胞术分别检测HUVECs细胞的存活和凋亡情况，并以Transwell法检测Ox-LDL诱导HUVECs细胞的迁移率及Matrigel基质胶观察细胞成管长度，以此在宏观的细胞层面观察薯蓣皂苷元对Ox-LDL诱导HUVECs细胞的影响。采用westernblot定量检测内皮-间质转化中的重要间质标志物蛋白（α-SMA和Vimentin）、内皮标志物蛋白（VE-cadherin和ZO-1）以及AKT/GSK-3β通路相关蛋白（TGF-β2、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β）表达水平，以微观的分子层面观察薯蓣皂苷元处理前后细胞的变化。 结果: 1.眼底照相及眼底荧光造影:眼底照相见均成功建立小鼠CNV模型，血管荧光造影显示:在模型组中，激光损伤在早期显示出高荧光，晚期激光损伤的大小及强度均增加，在薯蓣皂苷元治疗2周后，激光损伤大小及强度均明显减轻，并呈剂量依赖性的统计学差异。模型组、Dio50、Dio1003级激光损伤比分别为42％、37％、21％,Dio处理组的3级激光损伤的百分比显著低于我们的模型组。 2.光学相干断层成像检查(OCT):模型组小鼠视网膜下见高反射信号伴视网膜下积液，薯蓣皂苷元治疗组小鼠视网膜下高反射信号明显缩小，且无视网膜下积液。与模型组相比，薯蓣皂苷元治疗组小鼠CNV面积明显减少，具有剂量依赖性统计学显著差异(P＜0.01)。 3.免疫组化染色检查RPE-脉络膜-巩膜铺片检测CNV病灶面积:与模型组相比，薯蓣皂苷元治疗组模型小鼠CNV的面积明显减少，并呈剂量依赖性的统计学显著差异(P＜0.01)。 4.Westernblot检测CNV模型小鼠EndMT相关蛋白的表达:与正常组相比，模型组中的间充质细胞标志物α-SMA显著增加，内皮细胞标志物VE-cadherin显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，与模型组相比，50μM薯蓣皂苷元组中α-SMA降低，而VE-cadherin增加，差异具有统计学意义(P＜0.05),与模型组相比，100μM薯蓣皂苷元组中α-SMA显著降低，而VE-cadherin显著增加，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。 5.Westernblot检测CNV模型小鼠AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白的表达:与正常组相比，模型组中的TGF-β2、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.01),与模型组相比，10μMDio中p-AKT蛋白表达显著下降，差异具有显著统计学差异(P＜0.01),p-GSK-3β蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P＜0.05),与模型组相比，20μMDio及40μMDio中TGF-β2、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达显著降低，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。 6.细胞存活率:0μM、10μM、20μM和40μM的薯蓣皂苷元溶液处理Ox-LDL诱导HUVECs细胞，各组细胞存活率为100.71±7.104、103.33±10.07、105.77±9.50和110.33±7.02,各组存活率与0μM组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。 7.细胞凋亡率:模型组细胞凋亡率明显高于对照组(17.36±0.81vs1.22±0.23,P＜0.01)。与模型组相比，不同浓度薯蓣皂苷元溶液治疗可降低Ox-LDL诱导HUVECs细胞的凋亡率，其细胞凋亡率分别为13.66±0.80、11.35±0.65和8.20±0.52,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。 8.细胞迁移:模型组细胞迁移数明显高于正常组(210.00±9.94vs58.33±3.22,P＜0.01)。与模型组相比，不同浓度薯蓣皂苷元治疗可降低Ox-LDL诱导HUVECs细胞的迁移数，其细胞迁移数分别为160.71±7.77、137.32±6.11和116.31±8.62,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。 9.Westernblot检测Ox-LDL诱导HUVECs细胞EndMT相关蛋白的表达:与正常组相比，模型组中的间充质细胞标志物α-SMA、Vimentin显著增加，内皮细胞标志物VE-cadherin、ZO-1显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01),与模型组相比，10μMDio中α-SMA、Vimentin降低，VE-cadherin增加，差异具有统计学意义(P＜0.05),与模型组相比，20μMDio及40μMDio中α-SMA、Vimentin显著降低，而VE-cadherin、ZO-1显著增加，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。 10.Westernblot检测Ox-LDL诱导HUVECs细胞AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白的表达:与正常组相比，模型组中的TGF-β2、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.01),与模型组相比，10μMDio中p-AKT蛋白表达显著下降，差异具有显著统计学差异(P＜0.01),p-GSK-3β蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P＜0.05),与模型组相比，20μMDio及40μMDio中TGF-β2、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达显著降低，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。 8.MK-2206的EndMT相关蛋白的表达:与对照组相比较，模型组α-SMA、Vimentin表达上调，VE-cadherin、ZO-1蛋白表达下调，差异均具有统计学意义(P＜0.01),与模型组相比，MK-2206组中α-SMA、Vimentin表达下调，差异具有统计学意义(P＜0.05),40μMDio中α-SMA、Vimentin(P＜0.01)蛋白表达下降，VE-cadherin、ZO-1蛋白表达上调，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。特别对照组中α-SMA、Vimentin蛋白表达显著下降，VE-cadherin、ZO-1蛋白显著上调，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。。 结论: 1.薯蓣皂苷元能抑制激光诱导小鼠CNV的渗漏，减少CNV的面积，EndMT参与CNV的形成，可能通过调控AKT/GSK-3β信号通路抑制EndMT的发展，从而减轻CNV形成; 2.薯蓣皂苷元对Ox-LDL诱导HUVECs细胞有保护作用，且能抑制细胞迁移、成管，可能通过调控AKT/GSK-3β信号通路，抑制Ox-LDL诱导HUVECs细胞EndMT发生; 3.薯蓣皂苷元可能是辅助治疗CNV相关疾病（包括nAMD）的潜在候选药物之一。
NETL