摘要
目的:环境化学品数量逐年剧增，目前化学文摘社(CAS)注册的化学品已超过两亿种，传统方法难以满足大量化学品亟需开展健康风险评估的需求。另一方面，全球每年有数百万的动物用于生命科学研究，美国EPA已宣布逐年减少对使用哺乳动物研究的资助，采用传统动物实验完成毒性测试的化妆品已被禁止进入欧洲等国际市场，全球范围内替代毒理学方法策略和技术体系正悄然兴起。在此背景下，我国必须采取主动、提前布局，建立具有自主知识产权的毒性测试技术体系和标准，培养和储备替代毒理学人才，旨在为我国产品国际市场准入、进出口贸易保驾护航。因此，本研究采用计算毒理学方法，以高效分析暴露剂量和生物体生理反应之间的非线性量效关系。环境化学品暴露在我们日常生活中，在人体中产生氧化应激，引发呼吸系统、消化系统、心血管系统、神经系统等疾病。氧化应激下，核转录因子NF-E2相关因子2(Nuclearfactorerythroid-derived2-like2,NFE2L2)活化，并参与许多重要的生物过程如抗氧化反应、蛋白酶体稳态、线粒体呼吸、炎症、脂质代谢和细胞分化等，调控KEAP1-NRF2通路成为了治疗以氧化应激为特征的各种慢性疾病的潜在策略。为填补NRF2特异性活化机制及其系统定量的空白，我们使用不同类型NRF2激活剂特应活化NRF2通路，获取各蛋白半衰期、最大激活量、反应响应时间、剂量反应灵敏性、阈值区间等定量信息。本研究将可为KEAP1-NRF2通路的系统生物学研究做出贡献，并化学品健康风险评估和药物设计提供重要的定量数据。 研究方法:本研究采用计算毒理学毒性通路“自下而上”的方法，即由KEAP1、NRF2、KEAP1-NRF2复合物等基础分子元件构建成网络和分子通路，随后构建计算毒理学毒效动力学模型，对KEAP1-NRF2信号通路进行系统定量研究。ClassⅠ-Ⅴ类NRF2激活剂与ClassⅥ类NRF2激活剂活化NRF2的作用机制不同，ClassⅠ-Ⅴ类NRF2激活剂修饰KEAP1的不同半胱氨酸残基，导致KEAP1作为泛素连接酶(E3UbiquitinLigases,E3)连接酶接头抑制NRF2泛素化降解，从而稳定NRF2。ClassⅥ类NRF2激活剂直接与NRF2竞争与KEAP1结合，从而破坏KEAP1-NRF2关联。针对这两种截然不同的分子机制分别构建毒效动力学模型并编写相关常微分方程组。将KEAP1-NRF2通路中各蛋白在生理状态下和激活状态下的稳态浓度、半衰期、生成和解离速率、结合和解离常数等动力学参数带入常微分方程组，使用BerkeleyMadonna软件Rosenbrock(stiff)方法进行求解，随后进行通路层面的系统定量。研究两个模型中各蛋白的时间-效应、剂量-效应非线性定量关系，计算反应灵敏性LRCmax和nH的数值，确认剂量反应曲线的阈值区间。最终，比较ClassⅠ-Ⅴ类NRF2激活剂和ClassⅥ类NRF2激活剂加入后，细胞核中游离态NRF2的量效变化。 结果:1.ClassⅠ-ⅤNRF2激活剂活化NRF2的时间-效应结果表明，达到稳态后细胞核中总NRF2浓度最高，其次是细胞核中游离NRF2浓度，再次是全细胞中总NRF2浓度、胞质中总NRF2浓度，表达水平最低的是胞质中游离NRF2的浓度。2.通过对ClassⅠ-Ⅴ活化NRF2的剂量-效应定量，细胞核中游离的NRF2灵敏性希尔系数是1.15,局部最大反应系数是0.31。发现细胞核中KEAP1水平为500～750nM时，细胞核内游离NRF2剂量-效应灵敏性最高。3.通过对细胞核中总NRF2初始浓度对剂量-反应关系灵敏性影响的分析，发现ClassⅠ-Ⅴ类NRF2激活剂作用下，NRF2初始基础浓度为5～25nM时，剂量反应关系灵敏性最高。4.在ClassⅥNRF2激活剂作用时，胞核中总NRF2浓度最高，其次是胞核中游离NRF2浓度，再次是全细胞中总NRF2浓度、胞质中总NRF2浓度，表达水平最低的是胞质中游离NRF2的浓度。5.ClassⅥNRF2激活剂活化NRF2的剂量-效应定量研究表明，细胞核中游离NRF2,反应剂量反应灵敏性的希尔系数是1.09,局部最大反应系数是0.46。细核内KEAP1水平为500～750nM时，核内游离NRF2剂量效应灵敏性最高。6.通过对细胞核中总NRF2的初始浓度对剂量-反应关系灵敏性影响的分析，发现ClassⅥ类NRF2激活剂作用下，NRF2基础浓度为5～25nM时，剂量反应关系灵敏性最高。7.ClassⅥ类NRF2激活剂最大限度激活时，游离NRF2浓度比在ClassⅠ-Ⅴ类NRF2激活剂作用下产生的量更多。 结论:1.机制上，KEAP1对NRF2具有双重作用:一方面以极高亲和力捕获游离态的NRF2,另一方面通过介导NRF2的泛素化和降解，共同使得游离态的NRF2浓度在细胞质中处于极低状态。2.量效关系上，ClassⅠ-Ⅴ类NRF2激活剂存在阈值浓度，在超阈值浓度下可以较容易地激活NRF2;为了精确控制NRF2的激活，ClassⅥ类激动剂成为了首选。
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