摘要
目的: 四君子汤治疗溃疡性结肠炎(UC)具有很好的疗效，它的主要成分包括多糖、皂苷类等，其中多糖在四君子汤中占比很大，有研究表明四君子汤多糖对肠黏膜损伤有显著的修复作用。本实验通过建立溃疡性结肠炎小鼠模型探讨四君子汤多糖是否通过调控铁死亡降低炎症水平，修复肠黏膜屏障，减轻氧化应激损伤及调节铁代谢稳态以缓解UC,初步探讨四君子汤多糖通过调控铁死亡缓解溃疡性结肠炎的作用机理。 方法: 动物实验:通过DSS干预7天成功复制UC小鼠模型，造模成功后分别给予四君子汤多糖、柠檬酸铁、去铁酮7天。用硫酸-蒽酮法检测四君子多糖的纯度;制作HE染色病理切片观察结肠组织炎性细胞浸润和肠黏膜屏障损伤程度;氧化应激损伤指标GSH、SOD和MDA含量通过试剂盒检测;活性氧(ROS)冷冻切片观察结肠组织ROS堆积情况;肠组织电镜切片观察肠细胞线粒体变化;实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测肠组织IL-6、IL-10、IL-22等mRNA相对表达量;蛋白印迹法(WB)检测结肠组织ZO-1、Occludin和Occludin等蛋白表达量。 细胞实验:使用LPS在Caco-2细胞上建立炎症模型，并在未造模和造模的细胞上沉默Fth基因。实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测铁代谢相关指标Fth、DMT1、FPN、Tfr1及铁死亡指标Gpx4、Ptgs2、Slc7a11的mRNA相对表达量;蛋白印迹法(WB)检测结肠组织铁代谢及铁死亡等相关蛋白表达量。 结果: (1)与模型组相比，四君子汤多糖干预后明显增加了小鼠的结肠长度，减轻结肠组织炎性细胞浸润，降低了促炎因子IL-1β、IL-6等mRNA表达水平，上调抑炎因子IL-10、IL-22的mRNA表达水平，增加肠屏障主要蛋白Occludin、Claudin-1的蛋白表达水平(p＜0.01)。以上结果表明四君子汤多糖可以缓解小鼠的一般情况、减轻肠道炎症及肠黏膜屏障损伤。(2)与模型组相比，四君子汤多糖干预后明显上调了铁死亡相关指标Gpx4、Slc7a11的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01)，降低Ptgs2的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01)，改善UC小鼠肠细胞内线粒体的改变，增强肠组织内氧化应激指标ROS阳性信号，增加GSH、SOD的表达含量，减少MDA的表达含量(p＜0.01)。以上结果提示四君子汤多糖可以抑制UC小鼠肠道内的铁死亡，减轻UC小鼠体内氧化应激损伤。(3)与模型组相比，四君子汤多糖能够下调UC小鼠肠组织内铁代谢相关指标Fth、FPN的mRNA和蛋白表达水平，上调DMT1和Tfr1的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.01)。以上结果表明四君子汤多糖可以调节UC小鼠肠道内铁代谢途径。(4)为了明确铁死亡与UC的关系，给UC小鼠使用补铁剂(柠檬酸铁)和去铁剂(去铁酮)治疗后。与模型组相比，柠檬酸铁治疗后明显加重小鼠的一般情况及炎症反应，减少氧化应激相关指标GSH、SOD的含量，增加MDA的含量(P＜0.01),下调铁死亡相关指标Gpx4、Slc7a11及铁代谢相关指标DMT1和Tfr1的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01),上调铁死亡指标Ptgs2及铁代谢相关指标Fth、FPN的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01)。与模型组相比，DFP干预后明显改善了小鼠的一般情况及降低炎症水平，上调铁死亡相关指标Gpx4、Slc7a11及铁代谢相关指标DMT1、Tfr1的mRNA和蛋白表达水平，降低铁死亡指标Ptgs2及铁代谢相关指标Fth、FPN的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01);增加氧化应激指标GSH、SOD的表达含量，减少MDA的表达含量(P＜0.01)，以上结果表明补充铁剂会激活铁死亡加重UC，而给与去铁剂治疗后能够抑制铁死亡缓解UC。为了进一步研究铁代谢与铁死亡之间的关系，我们使用了Caco-2细胞进行体外实验，与NC组相比，沉默铁代谢指标Fth基因后明显降低铁代谢相关指标Fth、FPN、DMT1、Tfr1的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01),上调了铁死亡相关指标Gpx4、Slc7a11的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01)，降低铁死亡指标Ptgs2的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01);与NC组相比，沉默Fth并使用LPS造模后明显降低铁代谢指标Fth、Tfr1的mRNA表达水平(p＜0.01),上调了铁代谢指标DMT1、FPN的mRNA表达水平(p＜0.01)，升高铁死亡指标Slc7a11的mRNA表达水平(p＜0.01)，降低铁死亡指标Gpx4、Ptgs2的mRNA和蛋白表达水平(p＜0.01)。以上结果表明Fth基因对铁代谢及铁死亡相关基因都有调控作用，提示四君子汤多糖可能通过铁代谢来调控铁死亡缓解UC。 结论: 1、四君子汤多糖可以修复UC模型小鼠肠黏膜屏障，减轻结肠组织炎症水平，缓解肠炎; 2、四君子汤多糖可以通过铁死亡降低炎症水平，修复肠黏膜屏障及减轻氧化应激损伤来缓解结肠炎; 3、四君子汤多糖可以通过干预铁代谢维持结肠组织内铁稳态平衡来调控铁死亡以缓解结肠炎。
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