摘要
烟草(NicotianatabacumL.）是茄科烟草属的一年生草本植物，在中国的栽培历史悠久，是重要的经济作物。但是，烟草种植过程中易遭受病毒侵染，同时在生长期对水分的要求较高，如受到干旱胁迫会明显影响烟叶产量和质量。因此，如何提高烟草的抗病性以及抗干旱能力是亟待解决的关键问题。前期研究发现，氰丙氨酸合酶（CAS）和交替氧化酶（AOX）均有助于提高植物对非生物胁迫的抵抗力;其中CAS是植物体内解氰关键酶，可将氰化物代谢为无毒的氨基酸，而AOX是植物细胞呼吸电子传递链末端氧化酶，被证实参与了植物逆境生理调节。然而，关于CAS和AOX如何共同参与烟草植株抗逆响应机制还不清楚，尤其在抗病与抗旱方面研究甚少。为进一步明确两者对烟草抗病与抗旱响应过程中的作用地位和相互关系，本实验通过获得CAS和AOX基因超表达和沉默材料后，探究两者差异表达对烟草抗病毒及抗旱能力的影响。主要研究成果如下: 1.通过杂交及转基因植株鉴定，获得CAS和AOX基因超表达和沉默杂交种及其T2代种子，筛选出7株CAS和AOX均超表达烟草材料(CAS1-OE/AOX1a-OE)、6株CAS超表达和AOX沉默烟草（CAS1-OE/AOX1a-Ri）、3株CAS沉默和AOX超表达烟草（CAS1-Ri/AOX1a-OE）和2株CAS和AOX共同沉默烟草(CAS1-Ri/AOX1a-Ri）。 2.使用不同浓度PEG6000处理烟草，模拟干旱胁迫。胁迫第9d时,野生型（WT）植株开始萎蔫，CAS和AOX沉默植株（CAS1-Ri、AOX1a-Ri和CAS1-Ri/AOX1a-Ri）出现生长停滞、叶片黄化及局部褐色斑点，值得注意的是,CAS1-OE/AOX1a-Ri杂交植株也出现类似现象;同时，CAS和AOX超表达植株（CAS1-OE、AOX1a-OE、CAS1-Ri/AOX1a-OE和CAS1-OE/AOX1a-OE)表现出较强的抗旱效果，植株生长发育正常，叶片萎蔫不明显。随后通过分析比较呼吸速率、叶绿素、氰化物、MDA、SOD及POD含量发现，CAS和AOX基因超表达使烟草具有较强的抗旱能力，呼吸速率是野生型的1.8倍左右;而CAS1-OE/AOX1a-OE植株将CAS和AOX基因超表达结合使烟草获得更强抗旱性，让烟草呼吸速率进一步提高至野生型的2.59倍。 3.在黄瓜花叶病毒（CMV）胁迫处理下，WT和CAS1-OE/AOX1a-OE植株在第15d出现生长速度缓慢、叶片萎蔫和卷曲畸形，CAS1-OE/AOX1a-Ri、CAS1-Ri/AOX1a-Ri、CAS1-OE及AOX1a-Ri植株出现生长停滞、叶片萎蔫、卷曲畸形及黄化斑驳严重;CAS1-Ri/AOX1a-OE、CAS1-Ri和AOX1a-OE植株抗病性强于野生型，植株生长发育正常，叶片轻微畸形。通过比较分析不同材料在CMV病毒胁迫处理下呼吸速率、叶绿素、氰化物、MDA、SOD及POD含量发现，CAS基因沉默和AOX超表达增强烟草对CMV病毒表现出高抗性，呼吸速率是野生型的1.5倍左右;而CAS1-Ri/AOX1a-OE植株将CAS基因沉默和AOX基因超表达结合使烟草获得更高抗病性，使得烟草呼吸速率进一步提高至野生型的2.63倍。 4.进一步结合病毒和干旱胁迫共同处理烟草，实验结果表明，在CMV病毒和20％PEG6000胁迫处理下，野生型植株在第5d植株出现生长停滞、叶片萎蔫、卷曲畸形及黄化斑驳，CAS1-Ri/AOX1a-OE植株叶片除轻微畸形外，生长发育正常，CAS1-OE/AOX1a-Ri、CAS1-Ri/AOX1a-Ri和CAS1-OE/AOX1a-OE植株叶片出现严重畸形及斑驳;而在CMV病毒和30％PEG6000胁迫处理下，除CAS1-Ri/AOX1a-OE植株严重萎蔫尚且存活外，野生型、CAS1-OE/AOX1a-Ri、CAS1-Ri/AOX1a-Ri和CAS1-OE/AOX1a-OE植株在第5d全部死亡。通过进一步比较分析不同材料呼吸速率、叶绿素、氰化物、MDA、SOD及POD含量发现，CAS1-Ri/AOX1a-OE植株能够同时抵抗CMV病毒和干旱胁迫，将CAS1-Ri较好抗病性与AOX1a-OE较高抗旱性结合，进一步增强烟草抗病和抗旱能力。 综上，实验发现CAS和AOX基因超表达能够增强烟草抗旱能力，特别是AOX基因超表达植株抗旱效果更加明显。但是，CAS基因沉默材料表现出更强的抗病毒能力，其中CAS基因沉默和和AOX基因超表达的杂交材料表现出对CMV病毒更高的抗性。其次，本研究也表明CAS1-Ri/AOX1a-OE能显著提高烟草植株同时抗CMV病毒及抗旱能力。该研究及方法进一步增强烟草抗CMV病毒及抗干旱能力，并且为烟草种植及其他农作物抗生物胁迫和非生物胁迫育种提供参考。
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