摘要
目的: 卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，且其致死率最高。因其发病隐蔽，早期临床表现不显著，患者往往在首次确诊时已发生了盆腹腔转移，易复发，预后较差。流行病学研究表明，全世界卵巢癌的发病率逐年增加。因此，深入研究卵巢癌不同治疗策略，对于降低卵巢癌死亡率和改善预后具有理论和现实意义。 肿瘤微环境在卵巢癌的发展和转移等方面发挥着关键作用。肿瘤微环境中的巨噬细胞是最重要的免疫细胞，参与了卵巢癌的进展及转移等过程。肿瘤微环境中的巨噬细胞可大致分为两种类型，M1/M2表型。M1型巨噬细胞具有肿瘤杀伤能力，有助于发挥抗肿瘤适应性免疫反应;大多数肿瘤相关巨噬细胞为M2型巨噬细胞，具有抑制炎症并且促进肿瘤生长的作用。在某些条件下，这两种类型的巨噬细胞可以相互转化，利用巨噬细胞的极化可作为治疗卵巢癌的新思路。 Mn2+作为先天免疫STING-TBK1-IRF3通路激活剂之一，介导Ⅰ型干扰素(IFN-β)的产生。外在因素作用下，受损的细胞器会释放锰离子，一方面，锰离子对体内正常生理状态下的肿瘤进行免疫监视;另一方面，锰离子能够促进树突状细胞以及巨噬细胞的成熟和抗原的提呈，同时增强CD8+T细胞的分化和激活，有助于发挥抗肿瘤作用。锰离子作为免疫调节剂为肿瘤治疗提供了新的方向。目前，关于Mn2+在卵巢癌中的应用，国内外尚无相关研究。 白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)是一种促炎Ⅰ型细胞因子，发挥抑制肿瘤作用，是联合免疫疗法的较有前途的候选者。但是，IL-12全身应用的毒副作用制约了其在临床的广泛应用，目前多项研究发现通过局部给药以及与其它药物联合等方式，可降低单独用药的毒副作用，并且通过IL-12对免疫系统的活化作用提高治疗效果。 但是Mn2+是否通过STING-TBK1-IRF3通路参与巨噬细胞极化影响卵巢癌过程，以及Mn2+联合IL-12能否促进M1型巨噬细胞极化和激活T细胞的功能等均有待研究。因此，在本研究中借助生物信息学分析Mn2+和IL-12对于肿瘤微环境中巨噬细胞的基因调控作用，在体外实验验证Mn2+、Mn2+联合IL-12对巨噬细胞和T淋巴细胞的影响，在体内通过构建小鼠皮下移植模型，全面探讨Mn2+联合IL-12通过调控巨噬细胞激活体内免疫反应，发挥抑制卵巢癌进展的作用。 研究方法: 1、Mn2+对巨噬细胞的极化作用。 (1)将不同金属离子(Ca2+、Mg2+和Mn2+)作用于小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)后，使用WesternBlot实验检测STING、P-TBK1/TBK1、P-IRF3/IRF3蛋白表达变化。采用ELISA法测定不同金属离子(Ca2+、Mg2+和Mn2+)作用下巨噬细胞分泌IFN-β的情况。使用CCK-8法进行细胞活力检测，选出恰当的Mn2+给药浓度。 (2)通过生物信息学技术，分析Mn2+对巨噬细胞基因转录的调控作用，筛选出差异表达基因，采用基因本体(GO)富集分析、基因集富集分析(GSEA)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析，探讨Mn2+对巨噬细胞调控机制。 (3)利用WesternBlot法和qRT-PCR法检测M1型巨噬细胞标记物iNOS、CD80和CD86蛋白及基因水平表达情况，以及M2型巨噬细胞标记物Arg1、CD163、CD206蛋白的表达情况。 (4)利用qRT-PCR法和ELISA法检测促炎型炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因和蛋白水平表达。 (5)采用GFP标记的BMDM和pHrodo-Red标记的小鼠卵巢上皮肿瘤细胞(ID8)直接共培养的方法,利用流式细胞仪观察Mn2+处理后对于巨噬细胞吞噬能力的变化。利用WesternBlot法检测细胞黏附蛋白ICAM-1以及促进细胞吞噬能力的整合素MAC-1蛋白的表达。 2、体外验证Mn2+和IL-12对巨噬细胞、T细胞的影响。 (1)通过生物信息学技术，分析IL-12对巨噬细胞基因调控作用，同时与前部分Mn2+对巨噬细胞的差异基因进行比较，寻找关键调控基因。 (2)为评估Mn2+联合IL-12对巨噬细胞的影响，将ID8细胞与不同处理条件巨噬细胞(Mn2+组和联合用药组)培养，采用qRT-PCR检测干扰素调节因子7(IRF7)和干扰素-γ(IFN-γ)基因表达情况。 (3)将实验分为对照组、IFN-β中和抗体组、Mn2+组、Mn2+联合IL-12组分别处理巨噬细胞，通过ELISA法检测巨噬细胞中IFN-γ蛋白分泌情况。 (4)将巨噬细胞的IRF7敲低后，利用WesternBlot法检测IRF7、P-65/P65以及P-IκBα/IκBα蛋白表达情况。同时利用ELISA法检测敲低IRF7后的巨噬细胞IFN-γ蛋白分泌的情况。 (5)为评估Mn2+联合IL-12对T淋巴细胞的影响，将ID8细胞与不同处理条件巨噬细胞(Mn2+组和联合用药组)培养后，再与T淋巴细胞共培养，采用免疫荧光法观察记忆T淋巴细胞标记物CD44的表达情况;使用qRT-PCR检测穿孔素(Perforin)和白细胞介素-12Rβ1(IL-12Rβ1)的基因表达情况。 3、体内验证Mn2+和IL-12联合作用对巨噬细胞和T细胞的影响。 (1)建立卵巢癌皮下移植瘤模型，以4-6周龄的雌性C57小鼠为实验动物，利用ID8小鼠卵巢癌细胞系构建皮下移植瘤模型，实验包括空白对照组、Mn2+组、IL-12组、Mn2+联合IL-12治疗组，观察不同治疗组对小鼠体重的影响及肿瘤的变化。 (2)通过TUNEL染色观察小鼠肿瘤组织的凋亡情况，通过Ki-67染色观察小鼠肿瘤组织的增殖情况。 (3)通过免疫荧光法检测不同处理组的肿瘤组织CD80、CD86的表达情况，以及对巨噬细胞表面标志物F4/80(红色荧光)和M1型巨噬细胞标志物iNOS(绿色荧光)进行双重免疫荧光检测，以明确不同治疗方案中浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞的极化状态以及定位情况。 (4)通过ELISA测定不同治疗组小鼠血清中分泌的IFN-β、IFN-γ、TNF-α、趋化因子受体5(CCL5)、趋化因子(CXC基序)配体10(CXCL10)细胞因子含量。(5)利用免疫荧光观察肿瘤组织中CD4及CD8表达量，并结合CD3(红色荧光)和CD44(绿色荧光)双重免疫荧光检测，确定两种药物联合后，肿瘤组织中的记忆细胞数量。 (6)通过免疫荧光观察肿瘤组织中IL-12R表达情况，以及对小鼠脾脏进行免疫组化染色，观察CD44的表达情况。 (7)为了比较两组小鼠的长久抗肿瘤的能力，对肿瘤完全消退的小鼠进行二次肿瘤移植，观察肿瘤生长情况。 结果: 1、Mn2+促进巨噬细胞IFN-β炎症反应和抗肿瘤作用。 (1)Mn2+通过STING-TBK1-IRF3通路激活巨噬细胞，促进IFN-β分泌:与其他金属离子(Ca2+、Mg2+和Mn2+)相比，Mn2+有效促进STING-TBK1-IRF3通路中STING以及磷酸化TBK1和IRF3的蛋白表达(P＜0.05)，同时Mn2+显著促进巨噬细胞分泌IFN-β(P＜0.05)。 (2)生物信息学分析预测Mn2+促进M1型巨噬细胞极化:通过分析Mn2+对于巨噬细胞基因的调控作用，共筛选出560个差异基因，其中258个上调的基因，302个下调的基因。对差异基因进行GO和KEGG富集分析以及数据库GSEA分析，结果提示Mn2+具有促进巨噬细胞在先天免疫通路的激活作用，同时促进M1型巨噬细胞极化。 (3)Mn2+促进M1型巨噬细胞极化以及促炎性因子释放:实验分为空白组、阴性对照组(LPS)和Mn2+组，结果提示Mn2+组iNOS、CD80和CD86较空白组及LPS组的基因和蛋白水平均明显增加(P＜0.05)。进一步检测Mn2+对M1型巨噬细胞极化后促炎型炎症因子分泌的情况，Mn2+处理后IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达较空白组及LPS组的显著增高;ELISA检测其蛋白浓度表达趋势与qRT-PCR结果一致(P＜0.05)。 (4)Mn2+增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力:应用流式细胞术证实Mn2+可提高巨噬细胞吞噬肿瘤的能力。进一步利用WesternBlot法检测ICAM-1以及MAC-1蛋白的表达，结果显示，与单独ID8细胞共培养的BMDM组相比，添加Mn2+后的BMDM表达更多的ICAM-1以及MAC-1蛋白(P＜0.05)，从而进一步提高其对肿瘤细胞的吞噬作用。 (5)Mn2+减少肿瘤细胞诱导巨噬细胞极化为M2表型:利用WesternBlot法证实，与单独ID8细胞共培养的BMDM组相比，添加Mn2+后M2型标记物Arg1、CD163、CD206的蛋白表达明显减少(P＜0.05)。 2、Mn2+和IL-12的联合使用通过IRF7/NF-κB信号通路诱导巨噬细胞IFN-γ分泌，激活T细胞发挥抗肿瘤作用。 (1)IRF7作为IL-12和Mn2+对巨噬细胞的关键调控基因:通过生物信息学分析IL-12对于巨噬细胞的基因调控作用，筛查出的差异基因与前部分Mn2+处理的巨噬细胞的差异基因进行交集比较，结果提示Mn2+和IL-12存在相同的调控基因，其中14个上调基因和6个下调基因。我们对上调的14个基因进行KEGG富集分析，结果提示IRF7是IL-12和Mn2+对肿瘤微环境相关的巨噬细胞的关键调控基因。 (2)Mn2+联合IL-12组对巨噬细胞的协同作用:通过qRT-PCR结果提示联合用药的IRF7和IFN-γ基因表达较单独应用Mn2+组明显增加(P＜0.05)。 (3)IL-12协同Mn2+诱导的IFN-β促进了巨噬细胞IFN-γ的表达:应用ELISA法检测各种处理组细胞分泌IFN-γ的蛋白含量，结果显示联合治疗促进了大量的IFN-γ的产生，而单独使用Mn2+只产生少量的IFN-γ，当使用IFN-β中和抗体以消除分泌的IFN-β时，无IL-12处理的只有Mn2+培养的BMDM几乎不分泌IFN-γ,而IL-12协同Mn2+同时被IFN-β中和抗体处理显著降低了IFN-γ的蛋白分泌(P＜0.05)。 (4)Mn2+和IL-12联合使用通过IRF7/NF-κB信号通路激活IFN-γ的产生:巨噬细胞IRF7敲低后，无论单独使用Mn2+还是Mn2+联合IL-12培养巨噬细胞，IRF7、P-P65以及P-IKBα蛋白表达均减低(P＜0.05)。ELISA法结果与之相似，抑制IRF7的表达显著降低了IL-12与Mn2+协同处理的巨噬细胞的IFN-γ的分泌，几乎消除了Mn2+单独培养的IFN-γ的分泌(P＜0.05)。 (5)Mn2+联合IL-12组对T淋巴细胞的协同作用:通过免疫荧光方法显示联合用药组明显增强CD44的表达。通过qRT-PCR法证实联合用药组的Perforin和IL-12Rβ1基因表达较单独应用Mn2+组明显增加(P＜0.05)。 3、Mn2+联合IL-12促进M1型巨噬细胞极化并且激活T细胞。 (1)Mn2+联合IL-12组抑制小鼠肿瘤生长:将荷瘤小鼠随机分为4组(空白对照组、Mn2+组、IL-12组、Mn2+联合IL-12治疗组)，根据分组情况采用相对治疗方案。结果提示Mn2+组、IL-12组、Mn2+联合IL-12组的治疗均抑制肿瘤的生长，其中单独的IL-12组和联合治疗组都有部分小鼠的肿瘤完全消退，而联合治疗的小鼠肿瘤消退率达到80％(5只中4只小鼠的肿瘤完全消退)。 (2)Mn2+联合IL-12组增加肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞的生长:通过TUNEL荧光染色，结果提示联合治疗组较其他组阳性细胞数明显增加。通过Ki-67荧光染色，结果提示联合治疗组较其他组阳性细胞数量显著减少。 (3)Mn2+联合IL-12组促进M1型巨噬细胞表达:通过组织免疫荧光法，证明联合治疗组促进CD80和CD86的表达，进一步对小鼠肿瘤组织进行巨噬细胞表面标志物F4/80和M1型巨噬细胞标志物iNOS双重免疫荧光检测，结果同样提示联合用药组肿瘤组织中大部分浸润为M1型巨噬细胞。 (4)Mn2+联合IL-12组促进小鼠分泌多种细胞因子:通过ELISA测定了不同治疗组小鼠血清中M1型巨噬细胞分泌的IFN-β、IFN-γ、TNF-α、CCL5、CXCL10细胞因子含量，结果提示Mn2+组、IL-12组、Mn2+联合IL-12治疗组小鼠循环中的炎症因子和趋化因子水平显著高于对照组，联合治疗组小鼠循环中IFN-β、TNF-α较单独用药组有所增加(P＜0.05)，而3个治疗组中CCL5、CXCL10分泌水平没有统计学差异，其中我们发现与单独IL-12治疗相比，联合治疗组的IFN-γ在小鼠循环中的表达水平相对较低(P＜0.05)。 (5)Mn2+联合IL-12组增加杀伤T细胞浸润:对小鼠肿瘤组织进行免疫荧光检测,结果提示联合用药组CD4和CD8表达均明显升高。 (6)Mn2+联合IL-12组增强小鼠肿瘤记忆T细胞浸润:对小鼠肿瘤组织进行CD3和CD44双重免疫荧光检测，提示两种药物联用后，肿瘤内的记忆T细胞数量增多，其对卵巢癌的抑制效果持续时间更长。 (7)Mn2+联合IL-12组增加小鼠肿瘤中IL-12R的表达以及脾脏CD44的表达:对IL-12组和联合用药组的小鼠肿瘤组织进行IL-12R免疫荧光检测，提示与IL-12单独给药的疗法相比，联合用药组中IL-12R的表达显著增多。对肿瘤消除的小鼠的脾脏进行免疫组化染色，联合用药增加脾脏中CD44表达。 (8)二次种瘤实验证明Mn2+联合IL-12治疗抗卵巢癌有效:对肿瘤完全消退的小鼠进行二次肿瘤移植，结果提示联合治疗的小鼠肿瘤消退更快(5-11天)。 结论: 1、Mn2+通过STING-TBK1-IRF3通路激活巨噬细胞，促进M1型巨噬细胞极化及IFN-β分泌，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力，抑制肿瘤细胞诱导巨噬细胞向M2型极化。 2、Mn2+和IL-12联合使用通过IRF7/NF-κB信号通路激活IFN-γ的产生，从而发挥抗肿瘤作用。 3、Mn2+联合IL-12通过促进巨噬细胞极化和抗原提呈，促进CD8+/CD4+T细胞的瘤内浸润，增加CD44记忆T细胞的瘤内浸润和脾脏归巢，提高IL-12R的表达，从而抑制卵巢癌在体内的生长。
NETL