摘要
目的:研究益气解毒方对STAT5信号通路和CD4+CD25+Foxp3+Tregs的调控，探索益气解毒方减轻复发性单纯疱疹病毒性角膜炎(Herpessimplexkeratitis,HSK)炎性损伤的疗效和作用机制。 方法: 1.将90只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:空白组、潜伏感染组和复发组，每组30只。初次造模后5周紫外照射诱导复发，复发后检测小鼠的眼表评分和角膜擦拭液细胞的细胞病变效应(Cytopathiceffect,CPE)等来鉴定复发性HSK的造模成功率。 2.在确定有效的造模方法后，取90只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:空白组、复发组和益气解毒方(YiqiJieduFormula,YQJDF)组，每组30只。YQJDF组在复发前2周开始给药，复发后3天观察各组小鼠角膜染色情况和眼部体征评分;H&E染色观察角膜组织病理学表现;运用PCR检测角膜IL-4、CD11c、TGF-β、IL-17、IL-1β、CXCL1的mRNA表达;免疫荧光检测角膜细胞中F480、CD4、CD8、IL-10、CD4+Foxp3+Tregs的表达;免疫组化检测角膜F480、CD4、CD11c表达;通过流式细胞仪检测小鼠外周血及脾细胞CD4+CD25+Foxp3+Tregs,CTLA-4细胞数;ELISA检测血清及脾细胞IL-10、TGF-β、IL-17、CXCL1、IL-1β细胞因子水平;WesternBlot检测脾及眼球组织STAT5/p-STAT5、Neuropilin-1蛋白表达。 3.体外培养小鼠脾细胞，分选出CD4+CD25+Tregs后加入STAT5抑制剂和YQJDF药物血清培养。采用WesternBlot检测CD4+CD25+Tregs中STAT5/p-STAT5蛋白表达;通过流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞数;ELISA检测CD4+CD25+Tregs中IL-10、IL-1β表达;结晶紫法检测CD4+CD25+Tregs培养上清液的病毒抑制性。 4.采用不同HSV-1感染浓度和时间体外培养人角膜上皮细胞(Humancorneaepithelialcells,HCE),免疫荧光检测YQJDF药物血清对HCE细胞中CD4+Foxp3+Tregs表达的影响;ELISA检测HCE细胞培养中IL-17、IL-4的表达。 结果: 1.采用角膜划痕和不注射抗HSV血清法进行HSK初次造模，运用合适时间的紫外照射诱导HSK复发模型，角膜擦拭液细胞培养CPE病变率为71％,裂隙灯下观察到的小鼠角膜染色情况显示复发率为75％,但部分小鼠眼表有表现而细胞培养没有CPE病变，故两个指标综合计算复发模型成功率可达71％。 2.动物模型构建完成，经YQJDF处理后结果显示，与复发组相比，YQJDF组角膜染色更加透明，新生血管减少，眼表体征评分更低（P＜0.001）。H&E染色显示复发组角膜上皮细胞变性坏死，脱落，角膜水肿，大量的炎性细胞浸润;YQJDF组小鼠角膜上皮轻度水肿，未见明显的炎性细胞浸润。与空白组相比，复发组可以增加F480、CD4的荧光表达，经YQJDF处理后降低;YQJDF提高了CD8、CD4+Foxp3+Tregs的表达，IL-10的表达在组间未见明显差异。免疫组化的结果显示复发组F480、CD11c和CD4表达较空白组和YQJDF组明显增加。YQJDF可以促进抗炎功能细胞因子IL-4、TGF-βmRNA在角膜上的表达，减少促炎细胞因子IL-1β、CD11c、CXCL1和IL-17mRNA在角膜上的表达。与空白组比较，复发组降低了外周血和脾细胞中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs及CTLA-4表达，经YQJDF处理后表达上升。与空白组比较，复发组降低了外周血和脾细胞中的IL-10、TGF-β的表达，经YQJDF处理后表达上升。与空白组比较，复发组外周血及脾细胞中的IL-1β、CXCL1和IL-17表达上升，经YQJDF处理后表达下降。眼球及脾组织结果显示，与复发组相比，YQJDF组Neuropilin-1、STAT5蛋白磷酸化水平显著上升,Neuropilin-1、STAT5mRNA表达水平上升。 3.脾细胞分选后的CD4+CD25+Tregs中加入STAT5信号通路抑制剂进行培养。研究结果显示，与空白组比较，抑制剂组STAT5蛋白磷酸化水平下降，YQJDF组表达较STAT5抑制剂组升高。在CD4+CD25+Tregs中抑制STAT5信号通路后，与空白组比较，IL-10表达下降，CD4+CD25+Foxp3+Tregs的表达下降，经YQJDF血清处理后表达上升，IL-1β的表达组间未见明显差异。染毒Vero细胞的存活数结果显示，经YQJDF血清培养后的CD4+CD25+Tregs上清液对HSV-1毒力具有一定抑制作用。 4.体外采用YQJDF药物血清干预HCE,结果显示YQJDF可以提高HCE细胞CD4+Foxp3+Tregs荧光表达，升高IL-4水平同时下调IL-17水平。 结论: 1.采用角膜划痕和不注射抗HSV血清法进行HSK初次造模，运用合适时间的紫外照射诱导复发，可以成功构建复发性HSK小鼠模型。 2.YQJDF可以有效的降低复发后小鼠眼部体征评分，减少角膜炎性细胞浸润和新生血管生成，维持角膜透明度。 3.YQJDF可通过激活脾细胞中STAT5信号通路促进CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞表达发挥免疫调控作用，提高体内抗炎细胞因子TGF-β和IL-10的表达，通过全身免疫调节抑制炎症，帮助保护和修复角膜，减轻角膜炎性损伤。 4.YQJDF促进角膜CD4+Foxp3+Tregs细胞发挥免疫保护作用，增加角膜抗炎细胞IL-4、TGF-β表达，抑制促炎细胞因子IL-1β、IL-17、CD11c、CXCL1的表达，减轻复发性HSK小鼠角膜免疫病理损伤。 5.YQJDF可以提高HCE细胞的CD4+Foxp3+Tregs荧光表达，抑制促炎细胞因子IL-17的表达，一定程度促进抗炎细胞因子IL-4的表达，培养时间与培养浓度均为影响因素。
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