摘要
目的: 皮肤受到累及真皮深层的创伤后，往往形成瘢痕性愈合。成纤维细胞是创面组织修复的主要功能细胞，成纤维细胞的性能与伤口的愈合密切相关。研究表明，多种来源的外泌体能够促进损伤修复，减轻纤维化。而唾液有促进伤口愈合、减少瘢痕形成的作用，具体机制尚未明确，唾液中富含外泌体，因此，本研究拟探讨人唾液外泌体(saliva-derived exosomes，S-Exos)对人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblasts，HSFs)增殖、迁移、肌成纤维细胞活化和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分泌等特性的效应，并通过体内实验探索唾液外泌体对大鼠皮肤损伤修复的影响。通过体内、体外研究，阐明唾液外泌体在皮肤损伤修复过程中所发挥的生物学效应，并通过生物信息学分析，筛选唾液及唾液外泌体中的差异基因，选出富集最显著的通路，深入探讨其可能的作用机制。通过上述研究，期望能为皮肤瘢痕组织的防治研究提供新的实验资料，为唾液外泌体的临床应用提供实验依据和理论支持。 方法: 1.S-Exos的分离、提取及鉴定:收集健康成年人非刺激性全唾液，用PBS稀释后采用差速离心、超高速离心法和超滤法相结合提取S-Exos，BCA测定蛋白浓度，透射电镜观察S-Exos形态，Western blot检测外泌体标志性蛋白。 2.体外评价唾液及S-Exos对HSFs特性的影响:组织块贴壁法分离培养HSFs。分别用唾液和S-Exos与HSFs共培养，通过CCK-8细胞增殖实验、Transwell实验和实时荧光定量聚合酶链反应(Real time polymerase chain reaction，RT-qPCR)来评价唾液和S-Exos对HSFs特性的影响。 3.S-Exos影响HSFs特性的机制研究:1）通过GEO数据库分析唾液和唾液外泌体差异表达基因(DEGs)。随后，利用KOBAS3.0平台对S-Exos中上调的DEGs进行KEGG功能富集分析，富集的通路中，“PI3K/Akt信号通路”为富集最显著的通路。2）HSFs用S-Exos以不同的时间梯度处理，Western Blot检测处理后PI3K/Akt信号通路的激活情况; 4.体内探究S-Exos对大鼠皮肤损伤修复的影响及机制:选取30只6-8周龄雄性SD大鼠随机分为5组（对照组，saliva组，S-Exos组，S-Exos+LY294002组，LY294002组）。各组大鼠建立全厚皮肤缺损模型，术后48h，根据分组在创缘附近四个部位皮下注射不同的注射液100μL（每点25μL）。在术后第0、4、8、12、14天观察并拍照记录各组大鼠创面愈合情况，计算伤口愈合率。于术后第14和第35天处死大鼠，取创面皮肤组织，采用HE染色观察皮肤组织形态表现。 5.体外探究S-Exos通过PI3K/Akt通路对HSFs特性的影响:在S-Exos与HSFs细胞的共培养体系中加入PI3K抑制剂LY294002，通过CCK-8细胞增殖实验、RT-qPCR和Western Blot来检测S-Exos是否通过PI3K/Akt信号通路影响HSFs的特性及瘢痕相关因子的形成。 结果: 1.健康成年人唾液中可分离提取出S-Exos:唾液可分离提取出S-Exos。用透射电镜观察S-Exos，其具有双层膜结构，呈杯状，直径约70nm;Western blot结果显示，S-Exos表达生物标志物CD9和CD63。 2.S-Exos能够调节HSFs的特性:1）用组织块贴壁法从皮肤组织中成功分离培养出HSFs，细胞贴壁生长，呈纺锤形或梭形;2）唾液和S-Exos能促进HSFs的增殖，且S-Exos对HSFs增殖的促进作用比Saliva更稳定;3）Transwell实验结果显示，S-Exos对HSFs的迁移有抑制作用;4）RT-qPCR结果显示，与对照组相比，Saliva组和S-Exos组的HSFs中Ⅰ型、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)等瘢痕相关因子的mRNA合成减少，有助于抑制瘢痕形成的转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)因子的mRNA合成增加。 3.S-Exos能够通过激活PI3K/Akt信号通路:1）通过生物信息学方法，对唾液和唾液外泌体差异表达基因(DEGs)进行KEGG功能富集分析，选出PI3K/Akt通路;2)S-Exos与HSFs共培养0-120min，随着时间增加，Western blot检测出P-Akt的表达明显增强，PI3K/Akt信号通路被激活。 4.S-Exos能够通过PI3K/Akt信号通路促进大鼠皮肤损伤修复并减轻瘢痕形成:动物实验表明，S-Exos可以促进大鼠皮肤伤口面积收缩，损伤后第8天S-Exos组伤口愈合率明显提高，有统计学差异。HE染色结果示，S-Exos组在术后14天，可见创面新生组织中细胞数目及血管生成增多,35天可见胶原纤维有序平行排列，并有个别毛囊生成。加入PI3K信号通路抑制剂LY294002后可阻断S-Exos促进伤口部位组织再生的作用，表现为早期（术后4、8天）伤口收缩速度减弱，晚期（术后35天）瘢痕组织形成较外泌体组多，无皮肤附属器毛囊等形成。 5.S-Exos能够通过PI3K/Akt信号通路调节HSFs的特性:S-Exos通过促进PI3K/Akt信号通路的活化促进了HSFs的增殖;PI3K抑制剂LY294002通过阻断PI3K/Akt信号通路抑制了HSFs的增殖;抑制剂阻断后加入S-Exos，可以部分解除抑制剂对HSFs增殖的抑制作用。RT-qPCR及Western blot结果显示，S-Exos可以抑制HSFs瘢痕形成相关因子α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达，促进瘢痕抑制因子TGF-β3的表达。阻断PI3K信号通路会抑制HSFs以上所有因子的表达。 结论: 1.唾液中富含外泌体，S-Exos能显著增加HSFs增殖，抑制迁移。 2.S-Exos能抑制瘢痕形成相关因子的表达，促进瘢痕抑制因子的表达。 3.S-Exos能激活PI3K/Akt信号通路。 4.S-Exos能够通过激活PI3K/Akt信号通路促进大鼠皮肤全层损伤的愈合、促进损伤修复过程中的炎症细胞和真皮成纤维细胞的增殖，且有助于损伤部位皮肤组织恢复正常的组织形态。抑制PI3K信号通路可阻断S-Exos促进伤口部位组织再生的作用。 5.S-Exos能通过激活PI3K/Akt通路来促进HSFs的增殖，抑制PI3K信号通路可阻断S-Exos促进HSFs增殖的作用。然而，PI3K/Akt通路不是S-Exos调节HSFs合成ECM的主要途径。
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