摘要
目的和意义:目前，放射抗拒在临床上对鼻咽癌患者的病情控制构成了极大的挑战。本课题组先前发现膜联蛋白A3 (ANXA3)在鼻咽癌放射抗拒细胞株和裸鼠移植瘤中低表达。本研究通过构建ANXA3稳定过表达及沉默的鼻咽癌细胞，利用体内、体外实验探究ANXA3的差异表达对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响，并进一步研究由ANXA3调控的DNA双链断裂(DSB)的修复机制，明确ANXA3在EGFR-DNA-PKcs信号调节通路中的作用。本研究旨在阐明ANXA3介导的鼻咽癌放射敏感性的机制，揭示ANXA3可能成为克服鼻咽癌放射抗拒的治疗靶点，为鼻咽癌患者的放射增敏治疗提供新思路。 方法:1、通过RT-qPCR、Western blot实验验证ANXA3在鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R与鼻咽癌放射敏感细胞株CNE-2和C666-1中差异表达。运用慢病毒转染技术，在CNE-2R和C666-1中过表达ANXA3，在CNE-2中沉默ANXA3的表达。并通过CCK-8、克隆形成实验、Hoechst染色等体外功能试验验证ANXA3的差异表达对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。免疫荧光γ-H2AX焦点实验检测照射后鼻咽癌细胞DNA修复的情况。 2、为探讨ANXA3介导的鼻咽癌放射敏感性的DNA修复机制，用Western blot实验检测(p) EGFR、(p) DNA-PKcs、γ-H2AX的蛋白表达。通过免疫荧光实验检测ANXA3对放射诱导后的EGFR磷酸化及核内化的作用。单纯X线照射或西妥昔单抗联合X线照射处理细胞后，进行平板克隆实验验证西妥昔单抗对ANXA3沉默导致放射抗拒的逆转作用。 3、利用ANXA3差异表达的CNE-2R、C666-1和CNE-2细胞系构建裸鼠移植瘤模型，观察移植瘤大小;通过照射后TUNEL实验检测高表达ANXA3的CNE-2R移植瘤中细胞凋亡情况;免疫荧光检测照射后高表达ANXA3的CNE-2R移植瘤中ANXA3、γ-H2AX及相关凋亡蛋白(cleaved-caspase 3，Bcl-2)的表达水平。 结果:1、RT-qPCR和Western blot实验再一次验证了ANXA3在抗拒株CNE-2R中低表达，在敏感株CNE-2和C666-1中高表达。CCK-8、克隆形成实验、Hoechst染色等细胞功能试验证实沉默ANXA3增强鼻咽癌细胞放射抗性。利用免疫荧光实验发现鼻咽癌细胞在照射后半小时DNA损伤达到高峰，在24h DNA双链断裂逐渐修复完成，沉默ANXA3促进鼻咽癌细胞DNA双链断裂的修复，增强鼻咽癌细胞的放射抗性。 2、Western blot实验验证了沉默ANXA3可促进EGFR-DNA-PKcs通路的蛋白表达，且只调控照射后EGFR-DNA-PKcs通路，对未照射的鼻咽癌细胞中EGFR、p-EGFR、DNA-PKcs、p-DNA-PKcs、γ-H2AX的蛋白表达无影响。RT-qPCR实验发现ANXA3仅对EGFR、DNA-PKcs的蛋白层面进行调控，并未调节EGFR、DNA-PKcs的mRNA表达水平。免疫荧光实验表明ANXA3抑制EGFR的磷酸化及核内化，但西妥昔单抗可逆转上述情况。克隆形成实验表明西妥昔单抗可以逆转ANXA3沉默引起的辐射抗性。 3、裸鼠移植瘤实验表明，裸鼠照射前，实验组与对照组瘤体大小无统计学差异;经照射后，与对照组相比，高表达ANXA3的CNE-2R和C666-1组的瘤体生长呈现更加明显的抑制，而低表达ANXA3的CEN-2组则促进瘤体生长。TUNEL染色实验表明ANXA3促进移植瘤瘤体内的细胞凋亡。免疫组化实验表明ANXA3抑制DNA双链断裂的修复，促进鼻咽癌瘤体内细胞的凋亡，增强鼻咽癌放射敏感性。 结论:本研究通过体内、体外实验首次揭示了ANXA3在鼻咽癌放射敏感性和DNA双链修复机制中的关键作用，对ANXA3介导EGFR-DNA-PKcs信号通路增强鼻咽癌放射敏感性的机制进行了深层次的探究。为ANXA3成为潜在治疗靶点，提高鼻咽癌患者放射敏感性提供了依据。
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