摘要
目的： 研究海参酶酵液(HSMJY)对急性酒精性肝损伤(Acute alcoholic liver injury，AALI)的作用及其机制，为HSMJY应用于急性酒精性肝损伤提供实验依据。 方法： 1.实验小鼠造模及给药 将60只雄性昆明小鼠随机分为正常组、模型组、水飞蓟宾组(50mg/kg)、HSMJY高剂量组(7.8 g/kg)、HSMJY中剂量组(5.2 g/kg)、HSMJY低剂量组(2.6 g/kg)，10只/组。1-9天:预给药干预，正常组和模型组给予蒸馏水，其他处理组给予对应剂量的HSMJY及水飞蓟宾，每天灌胃1次，连续9天。9-12天:先正常给予药物，1h后除正常组外其他每组小鼠灌胃给予40％乙醇溶液(10 mL/kg)进行造模，连续4天。末次给予乙醇溶液后，实验小鼠禁食不禁水4h后，采集血液及脏器样本进行进一步实验分析。 2.HSMJY对AALI小鼠肝脏损伤、脂质代谢的影响 测定各组小鼠体质量、脏器指数;采用试剂盒检测各组小鼠血清AST、ALT、ALP、TG和TC;取肝脏制作组织切片H&E染色，观察肝组织的病理学变化。 3.HSMJY对AALI小鼠肝脏酒精代谢、氧化应激以及炎症的影响 采用试剂盒检测各组小鼠肝脏组织ADH、ALDH、SOD、MDA、GSH、IL-1β、IL-6和TNF-α水平; 4.海参酶酵液及急性酒精性肝损伤靶点的收集 基于文献调研HSMJY的化学成分，从中筛选活性成分;利用TargetNet数据库预测活性成分对应靶点。通过检索GeneCards数据库、OMIM数据库以及NCBI基因数据库获取急性酒精性肝损伤的相关靶点。将AALI的靶点与活性成分的靶点取交集后得到HSMJY抗AALI的潜在作用靶点。 5.PPI网络构建及核心基因的筛选 针对共同靶点，利用STRING数据库建立蛋白-蛋白互作网络(PPI)，进一步通过Cytoscape软件进行拓扑分析并筛选核心基因。 6.GO富集和KEGG通路富集分析 使用R软件对交集靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，取基因数排列靠前的条目进行可视化。 7.对主要通路相关指标进行实验验证 采用qRT-PCR法检测网络药理学预测靶标HSP90、AHR和CYP1A2的基因表达。 结果： 1.酒精成功诱导建立小鼠急性酒精性肝损伤模型 经酒精灌胃后，小鼠体重下降(P＜0.05)、脏器指数升高(P＜0.01或P＜0.05)，血清中AST、ALT和ALP异常升高(P＜0.01)。组织病理学检查结果显示，模型组小鼠肝细胞形态不规则，肝索排列紊乱，肝细胞内出现大小不等、数量较多的圆形脂肪空泡(脂滴)，出现了炎症细胞浸润现象，肝小叶结构模糊，个别小鼠肝小叶内见散在的肝细胞点状坏死，部分肝细胞核固缩，甚至消失，可见片状坏死。 2.HSMJY改善AALI小鼠肝脏损伤及脂质代谢紊乱 与模型组相比，HSMJY可显著降低AALI小鼠肝脏指数(P＜0.01)，HSMJY中、低剂量显著降低酒精致小鼠脾脏指数增加(P＜0.01);HSMJY可降低AALI小鼠血清中AST、ALT、ALP、TC及TG水平。此外，HSMJY可以改变肝脏组织病理学变化，明显减轻肝脏肝细胞坏死程度，保护肝组织结构的完整。 3.HSMJY改变酒精代谢酶活性，抑制氧化应激及炎症反应 与模型组相比，HSMJY可降低AALI小鼠肝脏中的乙醇脱氢酶(ADH)活性并增加乙醛脱氢酶(ALDH)活性(P＜0.01或P＜0.05)，可以显著降低AALI小鼠肝脏中MDA的含量(P＜0.01)，提高SOD活性(P＜0.01)和GSH的含量，同时还能降低AALI小鼠肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子的含量(P＜0.01或P＜0.05)。 4.靶点基因数及交集基因数 从数据库收集海参酶酵液的活性成分15个，潜在作用靶点共有69个。于GeneCards数据库、OMIM数据库及NCBI基因数据库搜索到急性酒精性肝损伤的靶点共有1754个;急性酒精性肝损伤与海参酶酵液的交集靶点共有23个。 5.核心基因预测 经STRING构建PPI网络，利用Cytoscape软件对其进行分析，计算相关参数。根据Degree值大小排序，核心基因为:ESR1、AHR、NR3C1、AR、HNF4A、HSP90AA1、CYP19A1、CYP2C19、CYP1A2和NR1H4。 6.GO富集和KEGG通路富集分析结果 通过GO富集和KEGG通路富集分析对交集靶点进行分析，主要参与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控、转录正调控，DNA模板化、细胞内受体信号通路等生物过程;细胞组分主要涉及细胞质、细胞膜、核浆、高分子配合物、内质网膜等;分子功能主要涉及锌离子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合、转录因子活性，序列特异性DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，序列特异性DNA结合、DNA结合等。相关信号通路主要包括:化学致癌-受体激活、神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、前列腺癌、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-活性氧、沙门氏菌感染、亚油酸代谢、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、病毒性心肌炎、甾类激素生物合成、花生四烯酸代谢、药物代谢-细胞色素P450等。本研究重点关注排在第一位的化学致癌-受体激活通路。 7.HSMJY可以抑制HSP90、AHR和CYP1A2基因的表达 qRT-PCR法对预测的部分靶点的验证结果显示，与正常组相比较，模型组小鼠肝组织的HSP90、AHR和CYP1A2显著升高(P＜0.01);与模型组相比较，水飞蓟宾组及HSMJY的高中低剂量组小鼠肝组织的HSP90、AHR和CYP1A2显著降低(P＜0.01)。 结论： 本研究成功构建AALI小鼠模型，实验结果表明海参酶酵液能够改善小鼠急性酒精性肝损伤，体现在抑制由酒精作用引起的脏器指数、部分血清转氨酶的升高，改善脂质代谢和组织病理学变化，调节酒精代谢，抑制氧化应激以及减少炎症反应。其作用机制可能与调控化学致癌-受体激活通路有关。
NETL