摘要
目的和意义:通过网络药理学和生物信息学预测灯盏花素治疗胰腺癌的相关分子靶点及分子作用机制;灯盏花素(Breviscapine，BVP)，也称作灯盏花乙素，是从灯盏花全株中提取的黄酮类化合物，主要分布在我国云贵高原。BVP具有多重生物活性，临床上主要用于改善血管及微循环、提高机体耐缺氧能力等作用等。在基础研究中许多研究证实了BVP的抗癌作用。胰腺癌，恶性程度高，治疗效果差，其有效治疗方案仍有待发掘，而BVP作为可能的抗肿瘤药物仍处在研究阶段。本研究旨在利用网络药理学结合生物功能学与机制学实验的模式，探讨BVP治疗胰腺癌的相关靶点，并探究初步的机制，为中医药防治胰腺癌提供相关理论基础 方法:整合GeneCards、OMIM、DrugBank、PharmGKB、TTD数据库检索的胰腺癌的疾病相关基因靶点，去重后得到所有胰腺癌相关的致病靶点。利用SwissTargetPrediction、Sea数据库收集BVP治疗相关的靶点，使用韦恩(Venn)在线软件对BVP作用靶点与胰腺癌致病靶点取交集获得共同基因靶点。使用Cytoscape3.7.2软件将BVP-作用靶点-通路图可视化。使用STRING在线数据库构建共同基因靶点的蛋白质相互作用PPI网络。利用METASCAPE数据对共同靶点进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。并通过以下生物学功能实验验证相关表型与通路，1.配置不同浓度的BVP(0、200、400、800umol/L)溶液，作用于人胰腺癌BXPC-3细胞48h，然后用CCK8 (Cell Counting Kit-8)法测定不同浓度的药物作用前后每组细胞的吸光度，观测药物对细胞活力以及抑制率随剂量的影响;2.按照对照组(正常状态下培养的BXPC-3细胞)和药物处理组(BVP处理48h后的BXPC-3细胞)制备电镜标本，利用透射电镜从微观水平观察细胞膜、线粒体、凋亡小体、溶酶体等相关细胞器的变化情况;3.通过细胞划痕愈合实验(Wound Healing)观测BVP处理后对细胞迁移能力的影响。4.流式细胞术检测不同浓度BVP对胰腺癌BXPC-3细胞周期分布的影响。5.采用原位未端标记法(TUNEL)法检测和流式细胞术检测BVP处理后BXPC-3细胞的细胞凋亡情况。6.采用免疫蛋白质印迹(Western blot，WB)方法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2和Casepase-3)、关键靶点蛋白(TNF-α和EGFR)和通路蛋白(AKT-1)相对表达量的改变。 结果:筛选出胰腺癌致病靶点4146个，药物作用基因靶点49个，其中有30个为BVP与胰腺癌的共同基因靶点，关键靶点包括表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子(TNF)、细胞白介素(IL-2)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2 (ABCG2)、环磷腺苷效应元件结合蛋白1 (CREB1)、多药耐药性蛋白(ABCB1)、细胞色素P450单氧化酶(CYP1A1)等。GO、KEGG富集分析结果显示，BP共富集14个生物进程，CC共富集6个细胞组分，MF共富集7个分子功能，KEGG共富集6个信号通路涉及胆汁分泌通路、癌症通路、PI3K-AKT信号通路等，其中PI3K-AKT信号通路富集程度较高。生物功能学实验结果:1.经含不同浓度BVP完全培养基处理48h后，CCK8和划痕愈合实验显示细胞活力呈剂量依赖式下降并且处理组的相对愈合面积显著低于空白对照组(P＜0.05);2.电镜下:与对照组相比，处理组的细胞可见凋亡小体，线粒体水肿、形状不规整，细胞内部呈现空泡化的结构。3.TUNEL染色结果显示:对照组几乎没有出现发红蓝色合并荧光的凋亡细胞.与对照组相比，药物处理组的凋亡细胞数量显著增加;4.流式细胞术检测细胞凋亡率:凋亡比率明显升高，分别为:3.86％±1.01％、5.49％± 3.67％、11％ ±6.97％和58.81.±10.01;6.同时免疫印迹法检测出:与对照组相比，抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达下调而Casepase-3表达水平无明显改变，靶点蛋白中抗增殖蛋白TNF-α的表达上调，EGFR表达下调，AKT-1相对表达量未见明显差异。 结论:本实验结果表明，BVP以剂量依赖性能抑制人胰腺癌BXPC-3的细胞活力与增殖，逆转永生化，诱导凋亡。其背后的机制可能是通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2和抗增殖蛋白TNF-α的表达，负性调控PI3K-AKT信号通路，从而促进了BXPC-3细胞的凋亡。
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