摘要
目的:急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是临床常见的急腹症，其发病机制可能与近年新发现的程序性死亡细胞焦亡相关。腹腔注射雨蛙肽建立大鼠AP模型，应用肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)抑制剂MG-132，通过观察大鼠胰腺损伤，细胞焦亡及炎症反应程度，探讨TRAF6在大鼠AP细胞焦亡中的作用机制。 方法:1、摸索TRAF6抑制剂MG-132影响大鼠AP细胞焦亡最佳干预浓度。将24只8周龄雄性SD大鼠随机分为:(1)Control组; (2)2.5mg/kg组;(3)5 mg/kg组;(4) 10 mg/kg组;(5) AP组;(6) AP+2.5mg/kg组; (7) AP+5 mg/kg组; (8) AP+10 mg/kg组，每组3只。造模前0.5 h，腹腔注射不同浓度(2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg) MG-132进行干预，随后所有AP组腹腔注射雨蛙肽(50 μg/kg，1h/次，共7次)建立AP模型，其余对照组同时注射等量生理盐水。于末次注射后24 h处死大鼠，收集血清和胰腺组织。通过观察大鼠胰腺组织病理变化，选取最佳干预浓度进行后续实验。2、将40只8周龄雄性SD大鼠随机分为:(1)Control组; (2) AP24H组; (3) AP24H+ MG-132组;(4) AP48H组;(5) AP48H+MG-132组，每组8只。造模前0.5 h，AP24H+MG-132和AP48H+MG-132组分别腹腔注射10 mg/kg MG-132进行干预，所有AP组腹腔注射雨蛙肽(50 μg/kg，1h/次，共7次)建立AP模型，Control组同时注射等量生理盐水。于末次注射后24 h和48 h处死各组大鼠，收集血清和胰腺组织。利用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色观察大鼠胰腺组织病理变化并进行病理评分;自动生化仪检测血清淀粉酶水平;原位末端转移酶标记法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)检测胰腺腺泡细胞晚期凋亡情况;免疫荧光检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)和GSDMD(gasdermin D)表达水平和定位以及透射电镜观察胰腺腺泡细胞超微结构变化。ELISA检测血清中炎症因子白介素-1β (interleukin-1 beta, IL-1β)和IL-18表达水平;实时荧光定量PCR (RT-qPCR)和免疫印迹法(western blot)检测Toll样受体9(toll-like receptor 9，TLR9)、TRAF6、核苷酸寡聚化结构域样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (nucleotide binding oligomerization domain-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3) 、caspase-1、 GSDMD和IL-1β的mRNA和蛋白表达情况;免疫组化检测GSDMD表达水平和定位。 结果:1、Control、2.5 mg/kg、5 mg/kg和10 mg/kg组病理评分未见明显变化(P＞0.05);AP组病理评分明显高于Control组(P＜0.05);AP+2.5 mg/kg、 AP+5 mg/kg和AP+10 mg/kg组胰腺损伤程度较AP组减轻，病理评分均低于AP组(P＜0.05)，且AP+10 mg/kg组最为显著，故选择10 mg/kg浓度进行后续实验。2、腹腔注射雨蛙肽建立大鼠AP模型，Control组未见明显病理改变，AP24H和AP48H组胰腺腺泡细胞出现明显水肿，周围可观察到大量炎症细胞，有出血灶，AP48H组可见少量坏死胰腺腺泡细胞。AP24H组病理评分和血清淀粉酶水平明显高于Control组(P＜0.05)，且随病程延长病理损伤加重(P＜0.05)。与Control组相比，AP24H组和AP48H组TUNEL结果显示胰腺腺泡细胞晚期凋亡率明显升高(P＜0.05);免疫荧光结果显示胰腺组织中caspase-1和GSDMD蛋白表达增强，主要表达于胞质中;透射电镜可观察到AP组细胞核发生明显固缩、线粒体肿胀、粗面内质网扩张，偶可见胰腺腺泡细胞发生坏死。ELISA结果显示血清炎症因子IL-1β水平明显上升(P＜0.05);RT-qPCR和western blot结果显示TLR9、TRAF6、NLRP3、caspase-1、 GSDMD和IL-1β的mRNA和蛋白表达量均明显上调(P＜0.05);免疫组化结果显示胰腺组织中GSDMD蛋白表达增强（P＜ 0.05），主要表达于胞质中，且以上结果都呈时间依赖性，均有统计学差异(P＜0.05)。应用TRAF6抑制剂MG-132进行干预后，相比AP24H和AP48H组，AP24H+MG-132和AP48H+MG-132组病理损伤明显改善，病理评分均显著降低（P＜ 0.05）。TRAF6抑制剂MG-132干预还可有效减少胰腺腺泡细胞晚期凋亡率(P＜0.05);减弱caspase-1和GSDMD蛋白表达;下调淀粉酶、血清IL-1β水平和细胞焦亡相关蛋白的mRNA和蛋白表达（P＜0.05）。 结论:1、AP的发病机制可能与激活细胞焦亡、扩大炎症反应有关;且随病程延长，胰腺损伤加重。2、TRAF6抑制剂可能通过抑制细胞焦亡、减少炎症反应，从而改善雨蛙肽诱导的大鼠AP胰腺损伤。
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