摘要
研究背景: 肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌，占所有原发性肝癌的80％以上，发病率和致死率均非常高。现阶段，乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染仍是我国HCC发病的主要原因。由于HCC的早期症状极不明显，并且临床上缺乏高敏感性和高特异性的诊断手段，大部分患者一经确诊，往往已是癌症晚期。同时，HCC具有高度异质性、肿瘤微环境(Tumormicroenvironment，TME)复杂、术后易复发和转移的特点，这些因素给HCC患者的治疗造成了极大的困难。目前，临床上的治疗方案包括肝移植、手术切除、经动脉化疗栓塞、射频消融和放射治疗等都能延长HCC患者的生命，但预后较差。 由于在发病过程中存在表观遗传变化、病毒感染、酒精滥用以及代谢异常等多种因素，因此HCC被认为是异质性最高的癌种之一。传统的治疗方案，主要是针对肿瘤细胞本身，但事实上HCC是在高度复杂且动态的TME中发展而来的。其中，肿瘤浸润淋巴细胞(Tumorinfiltratinglymphocytes,TILs)是宿主抗肿瘤免疫反应的主要利器，包含T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(Naturalkillercell,NK)等亚群。TILs的数量和质量在一定程度上决定了抗肿瘤免疫反应的最终效果。因而，探索TILs在HCC发生、发展微环境中的作用和机制对于改进HCC的诊断和治疗方式，改善晚期患者的预后和生活水平具有重要意义。 然而，在当前检测技术的限制下，人们对TILs的研究进展缓慢，所得成果在肝细胞癌中的应用也十分有限。单细胞测序技术是从单个细胞层面研究转录组，可保留肿瘤组织中更丰富的信息，以及发现一些稀有细胞群体的转录组信息，与传统测序手段相比具有更高的分辨率。通过单细胞RNA测序(Single-cellRNAsequencing，scRNA-seq)和T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)测序可以最大限度地反映TILs的异质性，进而特异性地鉴别TME中各细胞亚型及其对应的基因表达特征，并为阐明细胞状态转换的调控机理提供技术保障。本研究旨在利用scRNA-seq技术和TCR测序技术对HCC患者微环境中TILs的组成及其基因表达特征进行分析，同时也为了鉴定对肝癌发生发展起到关键作用的淋巴细胞亚群以及潜在的治疗靶点，为进一步发展HCC精准治疗，改善临床治疗效果提供理论基础。 材料与方法: 1.研究材料:肝癌切除手术中获得的新鲜肝细胞癌组织标本(P0301A、P0302A)以及配对的邻近正常肝脏组织标本(P0301B、P0302B)。 2.研究方法:组织标本解离，单细胞悬液制备，单细胞捕获、文库构建和转录组测序，单细胞测序质量控制，UMAP聚类可视化与细胞类型注释，各细胞亚群差异表达基因鉴定与相关信号通路富集分析，重点淋巴细胞亚群的拟时间分析，细胞亚群间通讯分析，TCR测序分析，免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)实验，生存预后分析。 研究结果: 1.单细胞RNA测序结果 本研究通过10xGenomicsChromium平台的质控与过滤，同时在什么过程中进行细胞周期矫正，减少其在聚类分析中的影响，最终获得了28479个细胞活性与质量均较高的单个细胞的RNA测序数据。 2.肝癌组织与癌旁正常组织中细胞亚群的鉴定 所有的测序细胞用Seurat[1]软件整合成17个细胞簇，并手工注释成13种不同的细胞类型。共鉴定出包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞(Dendriticcells,DCs)在内的11个免疫细胞亚群。其中，大多数CD8+T细胞聚集在癌旁组织中，而CD4+T细胞则在癌组织中浸润较多。相应组织切片的免疫组织化学实验结果也印证了这一结果。 3.肝癌浸润T淋巴细胞的聚类和分析 为了研究不同T细胞类型的亚群，根据相应的标记基因的表达，将所有T细胞重新聚类为不同的亚群。最后，确定了8个不同的T细胞集群，包括ActivatedCD8+T细胞、CD8+组织驻留记忆T细胞(Tissue-residentmemoryTcell,TRM)、NK-likeCD8+T细胞、NaiveCD4+T细胞、调节性T细胞(RegulatoryTcell,Treg)、FCER1G+T细胞、MT1E+T细胞和γδT细胞。其中，TRM细胞是肝癌邻近的正常组织中的优势群。ActivatedCD8+T细胞在肝癌相邻的正常组织中占优势，而在肝癌组织中，它们大多转化为衰竭T细胞，从而导致所占比例下降。取而代之的是NaiveCD4+T细胞和Tregs在肿瘤组织中占优势。FCER1G+T细胞和MT1E+T细胞不能定义为任何已知的T细胞亚群，故暂时以各自表达量最高的标记基因命名。其中，FCER1G+T细胞大量表达自然杀伤T(NaturalkillerT,NKT)细胞的相关标记基因，表明该组细胞可能与NKT细胞有着相似的功能和作用。 4.肿瘤浸润T淋巴细胞的差异表达基因分析 通过对肿瘤浸润的T细胞和邻近正常组织的T细胞进行差异表达基因分析发现，在不同的患者之间，肿瘤组织和相邻的正常组织中的差异基因是高度可变的。RGCC、CSRNP1、SMAD7、LMNA和BHLHE40基因的表达在P0301患者来源的肿瘤组织中普遍上调，基因本体论(GeneOntology,GO)功能多富集在“T细胞介导的免疫”和“细胞杀伤调节”。而上述基因在患者P0302中的表达并无显著差异，在癌组织中上调的是MT2A、MT1E、MT1X基因，GO功能偏向“趋化因子介导的信号通路”和“细胞因子活性”。以上结果证实了HCC患者极大的个体差异。此外，在目前已知的检查点相关基因中，CTLA4这一与耗竭相关的基因在肿瘤浸润的Treg细胞中的表达较高。 5.肿瘤浸润T淋巴细胞的拟时间轨迹分析 通过Monocle2算法分别对CD8+T细胞和CD4+T细胞进行了拟时间轨迹分析。在P0301中，我们发现CD8+T细胞的分化轨迹是由C5_ActivatedCD8+T细胞起始，过渡到C1_ActivatedCD8+T细胞，最后到C4_ActivatedCD8+T细胞。该结果表明，即使是被归为同一亚型的细胞，它们也不一定完全相同。在P0302中，C1_ActivatedCD8+T细胞与C4_ActivatedCD8+T细胞和C5_ActivatedCD8+T细胞在两个不同的分化方向相连。C0_NaiveCD4+T细胞位于拟时间轨迹的主干上，之后，C6_Treg细胞在轨迹示意图的分支点处向不同方向延伸。以上结果表明这些细胞可能处于不同的发育时期或位置，并在功能上有所分化。 6.肿瘤浸润T淋巴细胞的细胞间通讯分析 本研究运用CellChat软件包来探索不同细胞类型和疾病状况之间的细胞通讯模式。在肿瘤中上调的信号通路中，MIF-(CD74+CXCR4)在各种细胞间的相互作用中广泛活跃。相反，CLEC2C-KLRB1仅在γδT细胞与两个CD8+T细胞群的相互作用中显示出高度差异。每个细胞群在邻近的正常和肿瘤组织中都有不同的信号输入和输出模式。在两个患者中，C8_ActivatedCD8+T细胞和C4_RestingCD8+T细胞是接收最多传入信号的细胞。同时,在多种细胞类型中观察到相似的传出信号模式。而在所有配体-受体对中，MHC-1、MIF、CLEC、ITGB2是不同细胞类型中最常见的传入和传出分子。相较于癌旁对照组，在传出信号中观察到TNF、LAMININ、FN1、COLLAGEN具有更高的参与率。 7.HCC中NK细胞亚群的生态学分析 从主要细胞亚型分析中识别出的NK细胞中确定了三个不同的细胞亚群，包括两个NK细胞亚群(CD69highCD16highCD56lowNK细胞和CD69lowCD16highCD56lowNK细胞)。值得注意的是，一组CD8+T细胞也混入了聚类图中，可能是因为两者的表达谱相似度较高。所有的NK细胞亚群均表达较高水平的GNLY、GZMA、GZMB、NKG7和PRF1。而与CD69lowCD16highCD56lowNK细胞相比，IFNG的表达在CD69highCD16highCD56lowNK细胞中较高。在细胞因子水平方面，CD69highCD16highCD56lowNK细胞表达较高的TNF、IL2RG和IFNGR1。在NK亚群的比例组成方面,CD69highCD16highCD56lowNK细胞是P0301中主要的亚型，占NK细胞总数的近75％。然而，在P0302,两种细胞类型的比例几乎相同。 8.TCR测序和V-J基因的配对频率检测 通过对所有T细胞的TCR进行克隆分析，确定了HCC患者的克隆性T细胞扩增程度。从不同V基因家族的利用情况来看，P0301中T细胞受体β链(TheβchainofTcellreceptor,TRB)的主要V基因是TRBV6和TRBV9，而P0302中最多的是TRBV20和TRB28。不同V-J对的组合在每个病人中的存在情况是相似的。同时还计算了CDR3长度在每种链型中的分布，TRA和TRB的长度分别在6-21和5-21之间。由于TCR的功能需要α链和β链，我们分析了每个细胞中这两条链的信息。我们的测序数据中检测到了60％的完整双链。 9.基于单细胞RNA测序的TCR免疫谱系分析 通过scRNA-seq注释的细胞标签可以观察到大多数T细胞亚型中都有TCR的表达。然而，在C9_Tregs、C12_γδT细胞和C7_T细胞中检测到很少的TCR。结合患者的高年龄特征，推测是T细胞衰老现象导致了TCR数量和多样性的减少。在P0301的C3_CD8+T细胞、C4_RestingCD8+T细胞和C8_ActivatedCD8+T细胞中，细胞数大于100的“Hyperexpanded”克隆型是主要类型。在C1_ActivatedCD8+T细胞和C4_ActivatedCD8+T细胞中，这五个不同克隆扩增频率的细胞数量几乎相同。在P0302的C4_RestingCD8+T细胞、C1_ActivatedCD8+T细胞和C8_ActivatedCD8+T细胞中，多是“Hyperexpanded”的克隆型。而两位患者中的C0_NaiveCD4+T细胞亚群均出现较大比例的“Single”克隆型细胞。 10.肝细胞癌患者预后分析 通过结合癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)和基因型-组织表达(Genotype-TissueExpression,GTEx)数据库中肝细胞癌相关的数据集，我们分析了不同T细胞亚群对于肝细胞癌患者预后结局的影响。共有4个细胞亚群的分析结果具有显著差异(P＜0.05),它们分别是，C0_NaiveCD4+T细胞、C2_TRM细胞、C6_Treg细胞、C9_γδT细胞。其中，高度表达C0、C2和C9亚群的患者明显拥有更佳的预后，低表达C6Treg细胞的患者反而生存概率更高。之后，我们对各细胞亚群的标记基因进行了预后分析，得到了6个与患者预后显著相关的基因，分别是KLRB1、IL7R、ITGB1、CMC1、LGALS1和TNFRSF4。其中，IL7R、KLRB1和TNFRSF4基因具有成为肝细胞癌治疗靶点的潜力。 研究结论: 1.在HCC微环境中共检测出8个不同的肿瘤浸润T细胞亚群，其中包括FCER1G+T细胞和MT1E+T细胞两个首次发现的类NK细胞亚群。在肿瘤相邻的正常组织中活化的CD8+T细胞含量最高，而在肿瘤组织中，初始CD4+T细胞和Treg细胞的数量占优，表明微环境处于免疫衰竭或衰竭前状态。 2.肿瘤浸润T淋巴细胞的差异表达基因在不同的患者之间是高度可变的。RGCC、CSRNP1、SMAD7、LMNA和BHLHE40的表达在P0301的肿瘤组织中普遍上调，而在P0302的癌组织中上调的则是MT2A、MT1E、MT1X。这表明HCC患者的抗肿瘤反应具有非常大的个体差异。 3.在HCC微环境中，即使是被归纳为同一类型的CD8+T细胞亚群，也可能因为处于不同的发育位置或阶段，而在功能上有所差异，最终走向不同的细胞命运。 4.HCC肿瘤组织中存在多条高度活跃的信号通路，如MIF-(CD74+CXCR4)与CLEC2C-KLRB1,以及如MHC-1、MIF、CLEC、ITGB2的多种转录因子，它们共同构成了微环境中复杂的基因调控网络，参与免疫异常激活和免疫抑制的过程。 5.TCR克隆型的组成在不同组织间存在差异。NaiveCD4+T细胞因为处于初始未激活状态而拥有最多的“Single”克隆型。相反，肿瘤浸润的CD8+T细胞克隆扩增率很高。不同的T细胞亚群并不是完全隔离的，它们之间可能会发生广泛的状态转换。 6.不同T细胞亚群对肝癌患者的预后影响差异巨大。体内拥有更高水平的C0_NaiveCD4+T细胞、C2_TRM细胞、C9_γδT细胞的患者往往拥有更好的预后，而C6_Treg细胞作为危险因素，体内富集水平越低则患者预后结局越好。同时确定了IL7R、KLRB1和TNFRSF4这三个可作为治疗靶点的预后相关标记基因。
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