摘要
目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率呈逐年递增趋势。肺癌中最常见的是肺腺癌。靶向治疗是目前晚期非小细胞肺癌最常见的治疗方法之一，表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）的激活能够促进肺癌细胞分化和增殖，EGFR的过度表达则会引起肺癌的预后不良。吉非替尼是靶向治疗最常使用的药物之一，但应用一段时间后发生EGFR-TKIs获得性耐药。肿瘤相关基因的表达改变与肿瘤的耐药机制息息相关。通过探索NSCLC发生机制与吉非替尼耐药机制，找寻更有效的分子治疗靶点进而改善吉非替尼耐药的意义非常重大。 环状RNA（circularRNA,circRNA）参与了肿瘤的发生、进展、耐药形成等生物学过程，是肿瘤靶向治疗中极其重要的分子靶点。circRNA能干预肿瘤的发生、进展等过程。微小核糖核酸（microRNA,miRNA）能够于转录后对基因表达进行水平调控。circRNA主要通过与miRNA结合、间接调控miRNA下游靶基因的表达，进而干预肿瘤细胞的生长、侵袭、凋亡等过程。 circ_0006988是一种同肿瘤息息相关的基因调控因子，在肿瘤的发生及进展等过程中发挥着至关重要的作用，且可能参与肿瘤耐药相关的产生过程。 本研究实验意在探究circ_0006988在PC-9/GR细胞及A549/GR细胞吉非替尼耐药方面的具体影响及其对下游的相关调控机制。 研究方法: 第一部分 用实时定量聚合酶链反应（实时定量PCR/real-timequantitativePCR，RQ-PCR）法检测吉非替尼耐药患者的人肺腺癌组织及肺腺癌细胞、吉非替尼不耐药的人肺腺癌组织及肺腺癌细胞、PC-9细胞、PC-9/GR细胞、A549细胞、A549/GR细胞及BEAS-2B细胞（人正常支气管上皮细胞）中circ_0006988的具体表达差异。用细胞转染调控肺腺癌细胞（PC-9细胞、A549细胞）及其吉非替尼耐药细胞（PC-9/GR细胞、A549/GR细胞）内的circ_0006988表达水平，再予吉非替尼分别对各组细胞进行处理，通过流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡，用平板细胞克隆形成实验检测每组细胞克隆，用Transwell实验检测每组细胞的迁移和侵袭能力，用2-NBDG检测每组细胞的糖酵解，再用WesternBlot（WB）法检测细胞中AKT、PTEN、p-AKT和mTOR蛋白的表达水平。 第二部分 用circinteractome数据库预测到circ_0006988与miR-491-5p有互补结合位点，用双荧光素酶报告基因测定及RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验验证其靶向关系。用PCR法检测上调circ_0006988或下调circ_0006988对PC-9细胞、PC-9/GR、A549细胞、A549/GR细胞中miR-491-5p表达水平的影响。通过细胞转染和吉非替尼处理各组肺腺癌细胞及其吉非替尼耐药细胞，检测各组细胞内miR-491-5p对circ_0006988调控细胞凋亡、克隆、迁移、侵袭、糖酵解及相关蛋白表达水平的影响情况。 第三部分 通过ENCORI软件预测出miR-491-5p同有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(MAP3K3)的3''UTR端有互补结合位点，用双荧光素酶报告基因系统和RNA下拉(RNApull-down)实验验证二者的靶向关系。用PCR法和WB法检测下调miR-491-5p或上调miR-491-5p对PC-9细胞、PC-9/GR细胞、A549细胞、A549/GR细胞中MAP3K3表达的影响。通过细胞转染和吉非替尼处理各组肺腺癌细胞及其吉非替尼耐药细胞，检测各组细胞内MAP3K3对miR-491-5p调控细胞凋亡、克隆、迁移、侵袭、糖酵解及相关蛋白表达水平的影响情况。用WB法检测分析调控circ_0006988对肺癌细胞及其吉非替尼耐药细胞内MAP3K3表达的影响。 第四部分 通过调控MAP3K3水平和用吉非替尼处理各组肺腺癌细胞及其吉非替尼耐药细胞，用吉非替尼处理各组细胞，检测各组细胞的凋亡、克隆、迁移、侵袭、糖酵解及相关蛋白表达水平。用PCR法检测吉非替尼不耐药患者的肺腺癌组织同吉非替尼耐药患者的肺腺癌组织中MAP3K3信使RNA(MessengerRNA,mRNA)、mTORmRNA的表达水平变化，计算及分析肺腺癌组织中mTOR与MAP3K3两者间的相关性;利用免疫沉淀(Immuno-precipitation,IP)实验来检测PC-9/GR细胞、A549/GR细胞中MAP3K3和PTEN的相互作用。用WB法测定及解析下调MAP3K3后对PC-9/GR细胞、A549/GR细胞PTEN泛素化降解的影响。将下调了MAP3K3的PC-9/GR细胞、A549/GR细胞移植至裸鼠皮下，用吉非替尼治疗裸鼠，观察移植瘤的重量及生长体积，通过HE染色法进行染色，通过TUNEL法进行染色，观察移植瘤组织的细胞凋亡程度，用WB法检测移植瘤组织的mTOR蛋白表达水平。 结果: 第一部分 1.circ_0006988在吉非替尼耐药患者的人肺腺癌组织中的表达水平显著高于不耐药患者的（***P＜0.001）;与BEAS-2B细胞比，circ_0006988在A549细胞中的水平较高（*P＜0.05），在PC-9细胞中更高（**P＜0.01）。circ_0006988在PC-9/GR细胞中的表达水平明显高于PC-9细胞（P＜0.05）;circ_0006988在A549/GR细胞中的表达水平明显高于A549细胞中的表达水平（P＜0.05）。 2.上调circ_0006988抑制吉非替尼刺激后的PC-9、A549细胞的凋亡，促进了细胞的克隆、侵袭、迁移，提高了细胞的葡萄糖摄取量及乳酸产量，抑制了PTEN蛋白的表达，促进了p-AKT蛋白、mTOR蛋白的表达。 3.下调circ_0006988促进吉非替尼刺激后的PC-9/GR、A549/GR细胞的凋亡，抑制了细胞的克隆、侵袭、迁移，降低了细胞的葡萄糖摄取量及乳酸产量,抑制了mTOR、p-AKT的蛋白表达，促进了PTEN的蛋白表达。 第二部分 1.双荧光素酶报告基因系统及RIP实验证实了circ_0006988同miR-491-5p互为靶向的关系。 2.上调circ_0006988能抑制PC-9细胞、A549细胞中miR-491-5p的表达，下调circ_0006988则促进PC-9/GR细胞、A549/GR细胞中miR-491-5p的表达。 3.miR-491-5pmimics能够逆转上调circ_0006988对吉非替尼刺激后的PC-9、A549细胞的克隆、侵袭、迁移、凋亡、乳酸产量、葡萄糖摄取的影响，能逆转上调circ_0006988对吉非替尼刺激后的PC-9、A549细胞中mTOR蛋白、p-AKT蛋白、PTEN蛋白表达的影响;miR-491-5pinhibitor能够逆转下调circ_0006988对吉非替尼刺激后的PC-9、A549细胞的克隆、侵袭、迁移、凋亡、乳酸产量、葡萄糖摄取的影响，能逆转下调circ_0006988对吉非替尼刺激后的PC-9、A549细胞中mTOR蛋白、p-AKT蛋白、PTEN蛋白表达的影响。 第三部分 1.双荧光素酶报告基因系统和RNApull-down实验证实了miR-491-5p与MAP3K3互为靶向的关系。 2.上调miR-491-5p可抑制MAP3K3在PC-9/GR细胞、A549/GR细胞中的表达;下调miR-491-5p可促进MAP3K3在PC-9/GR、A549/GR细胞中的表达。 3.pcDNA-MAP3K3能逆转上调miR-491-5p对吉非替尼刺激后的PC-9/GR、A549/GR细胞的克隆、侵袭、迁移、凋亡、乳酸产量、葡萄糖摄取及mTOR、p-AKT、PTEN蛋白表达的影响;MAP3K3siRNA能逆转下调miR-491-5p对吉非替尼刺激后的PC-9、A549细胞的克隆、侵袭、迁移、凋亡、乳酸产量、葡萄糖摄取及mTOR、p-AKT、PTEN表达的影响。 4.上调circ_0006988能增强PC-9、A549细胞中MAP3K3的表达，miR-491-5pmimics逆转了这个过程;相应的，下调circ_0006988能够减弱PC-9/GR细胞、A549/GR细胞中MAP3K3的表达水平，miR-491-5pinhibitor逆转了这个过程。 第四部分 1.下调MAP3K3促进吉非替尼刺激的PC-9/GR、A549/GR细胞的凋亡及PTEN蛋白表达，抑制乳酸产量、葡萄糖摄取及mTOR、p-AKT的蛋白表达;上调MAP3K3抑制吉非替尼刺激的PC-9、A549细胞的凋亡及PTEN蛋的表达，促进乳酸产量、葡萄糖摄取及mTOR、p-AKT的蛋白表达。 2.在吉非替尼耐药的肺腺癌组织中MAP3K3mRNA及mTORmRNA的表达水平均高于吉非替尼不耐药的肺腺癌组织;MAP3K3与mTOR的表达水平为正相关（R=0.7298,***P＜0.001）。 3.MAP3K3和PTEN存在相互作用，下调MAP3K3抑制PTEN泛素化降解。 4.下调MAP3K3后PC-9/GR、A549/GR细胞的裸鼠移植瘤的生长体积与重量都显著下降、细胞凋亡显著增多、mTOR蛋白表达水平显著下降。 结论: 1.circ_0006988在吉非替尼耐药的人肺腺癌组织、PC-9/GR细胞、A549/GR细胞中呈高表达。 2.circ_0006988靶向负调控miR-491-5p,miR-491-5p靶向负调控MAP3K3,circ_0006988通过海绵吸附miR-491-5p调控MAP3K3的表达，进而发挥调控PC-9/GR、A549/GR细胞的功能。下调circ_0006988促进PC-9/GR、A549/GR细胞的凋亡，抑制细胞的侵袭、迁移、克隆和糖酵解能力，促进PTEN蛋白的表达,抑制p-AKT、mTOR蛋白的表达，抑制细胞的吉非替尼耐药及裸鼠移植瘤生长。 3.circ_0006988影响PC-9/GR、A549/GR细胞吉非替尼耐药的作用机制与miR-491-5p/MAP3K3基因调节PTEN/AKT/mTOR信号通路有关。
NETL