摘要
目的:在骨关节炎(Osteoarthritis，OA)中，具有促炎作用的M1型巨噬细胞和具有抗炎修复功能的M2型巨噬细胞之间的比例存在不平衡，并且倾向于M1亚型，同时该失衡程度与OA的严重程度密切相关。因此，调控巨噬细胞从M1向M2极化，是一种关节炎治疗的新思路。为此，本研究将叶酸(Folic acid，FA)修饰到金属有机框架材料UiO-66-NH2上，然后负载抗炎药物黄芩苷(Baicalin，Bai)，制备出具有良好生物相容性的靶向型Bai@FA-UiO-66-NH2纳米载药体系，并进一步探索Bai@FA-UiO-66-NH2的体外抗炎作用，为骨关节炎治疗提供科学依据。 方法:(1)靶向纳米载体FA-UiO-66-NH2的制备和表征:首先利用水热法制备金属有机框架材料UiO-66-NH2，再通过EDC/NHS系统催化的缩合反应对FA与UiO-66-NH2进行缩合，制备出具有靶向性的纳米载体FA-UiO-66-NH2。通过X衍射线(X-ray Diffraction，XRD)、傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR)、紫外-可见光谱(Ultraviolet and Visible Spectroscopy, UV-vis)、扫描电镜(Scanning Electron Microscope，SEM)、透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM)、X射线光电子能谱(X-ray Photoelectron Spectroscopy，XPS)能量散射X射线光谱(Energy Dispersive X-ray Spectrometer，EDS)、动态光散射谱(Dynamic Light Scattering，DLS)、Zeta电位、氮气等温吸脱附曲线以及热重分析(Thermogravimetric Analysis，TGA)等物化表征手段对产物进行结构性分析。 (2) FA-UiO-66-NH2负载Bai的性能研究:将黄芩苷负载于FA-UiO-66-NH2，制备成靶向型纳米载药体系Bai@FA-UiO-66-NH2。使用紫外-可见光谱对其进行表征，利用DLS分析其粒径和Zeta电位;并通过离心法和透析法测定靶向型载体FA-UiO-66-NH2对黄芩苷的载药释药性能。 (3)靶向型纳米载药体系Bai@FA-UiO-66-NH2的体外抗炎作用:首先使用CCK-8和Calcein-AM/PI活/死细胞染色试剂来研究Bai@FA-UiO-66-NH2的生物相容性。再通过DCFH-DA活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)染色试剂盒来检测Bai@FA-UiO-66-NH2对RAW264.7细胞内ROS的清除能力。最后使用qRT-PCR和免疫荧光染色技术以研究Bai@FA-UiO-66-NH2调控巨噬细胞M1向M2极化的能力，进一步分析其抗炎作用。 实验结果:7(1)靶向纳米载体FA-UiO-66-NH2的制备和表征:成功制备金属有机框架材料UiO-66-NH2和靶向纳米载体FA-UiO-66-NH2，并进行表征。XRD、FT-IR和UV-vis结果表明成功制备了金属有机骨架材料UiO-66-NH2和靶向纳米载体FA-UiO-66-NH2。SEM和TEM结果显示UiO-66-NH2和FA-UiO-66-NH2均为表面光滑均匀的正八面体结构，粒径约为100-150 nm且具有较好的分散性。EDS和TEM-mapping进一步表面靶向型纳米载体FA-UiO-66-NH2的表面均匀分布C、N、O、Zr元素。此外，XPS结果显示和UiO-66-NH2相比，FA-UiO-66-NH2的N元素含量提升至9.15％，间接证明叶酸改性成功。 此外，DLS粒径、Zeta电位、TGA以及氮气等温吸脱附实验结果进一步表明UiO-66-NH2和FA-UiO-66-NH2粒径分布良好，为介孔结构，并且具有较好的水稳定性和热稳定性。 (2) FA-UiO-66-NH2负载Bai的性能研究:成功制备靶向型纳米载药体系Bai@FA-UiO-66-NH2，并对其进行表征和载药释药性能研究。UV-vis结果显示成功制备靶向纳米载药体系Bai@FA-UiO-66-NH2，DLS和Zeta电位分析结果表明靶向纳米载药体系Bai@FA-UiO-66-NH2粒径分布均匀，具有较好的水稳定性。载药实验结果表明，当Bai与FA-UiO-66-NH2的投料重量比为7.5时，FA-UiO-66-NH2对Bai载药率和包封率达到最大值，分别为79.05％和56.62％。释药实验结果表明，在pH=7.4的PBS环境中，Bai@FA-UiO-66-NH2表现出明显的突释效应;但是在pH=5.0时，则Bai@FA-UiO-66-NH2表现为缓慢释放，并在48 h内达到最大释药率(72.08％)。 (3)Bai@FA-UiO-66-NH2体外抗炎作用研究:CCK-8和Calcein-AM/PI活/死细胞染色结果显示Bai、UiO-66-NH2、FA-UiO-66-NH2以及Bai@FA-UiO-66-NH2对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用均成剂量依赖性，同时Bai@FA-UiO-66-NH2还对RAW264.7巨噬细胞具有一定的保护作用。DCFH-DA活性氧染色结果显示，和Bai相比，Bai@FA-UiO-66-NH2对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞内的ROS的清除能力更强。qRT-PCR结果显示，和LPS组、Bai组相比，Bai@FA-UiO-66-NH2能够明显下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞内的炎症相关基因(IL-1β和IL-6)和M1极化相关基因(CD86和iNOS)的表达，并且能够明显上调M2极化相关基因(CD206、IL-10和Arg-1)的水平。免疫荧光结果进一步表明Bai@FA-UiO-66-NH2能下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞内的iNOS蛋白表达和上调CD206蛋白的表达，这说明Bai@FA-UiO-66-NH2可以通过调控巨噬细胞M1向M2极化，从而达到抗炎作用。 结论:本研究成功制备了靶向纳米载体FA-UiO-66-NH2，并且具有较好的分散性和水热稳定性。靶向型纳米载体FA-UiO-66-NH2对Bai有着良好的负载能力;Bai@FA-UiO-66-NH2对Bai的释放具有缓释作用，可作为Bai的载体。同时载药纳米体系Bai@FA-UiO-66-NH2具有较好的生物相容性、对RAW264.7巨噬细胞存在较好的保护作用以及抗氧化性能。此外Bai@FA-UiO-66-NH2还可以通过调控巨噬细胞极化M1向M2极化，从而在体外对抗炎症。
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