摘要
目的和意义:建立结直肠癌（CRC）裸鼠皮下移植瘤模型和远处转移模型，观察miR-146a和外泌体miR-146a对CRC、CRC远处转移以及上皮细胞间充质转化（EMT）相关标志物的作用，以及在肝、肺的富集情况。探讨其对CRC及CRC远处转移的作用机制。 方法:（1）皮下移植瘤模型:28只裸鼠右侧腋下接种LoVo细胞。1周后触摸硬结存在，确认为成瘤。4周后将裸鼠完全随机分为四组，分别为外泌体组/PBS组/miR-146a-Negativecontrol（miR-146a-NC）组/miR-146a组，测量瘤体体积;于尾静脉分别注射0.1ml低表达外泌体miR-146a患者血浆外泌体浓缩液/无菌PBS溶液/miR-146aagomirNC溶液/miR-146aagomir溶液，每3天1次，一共6次。其中外泌体组为实验组，其对照组为PBS组;miR-146a组为实验组，其对照组为miR-146a-NC组。每3天测量瘤体体积，记录生存时间，9周后处死存活裸鼠。切除移植瘤组织进行HE染色和免疫组化染色，分析四组瘤体E-钙粘蛋白（E-cadherin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）、波形纤维蛋白（vimentin）表达变化。 （2）远处转移瘤模型:28只裸鼠尾静脉注射LoVo细胞。2周后处死1只裸鼠观察肝脏大体标本有无转移。3周后将裸鼠完全随机分为四组，分别为外泌体组/PBS组/miR-146aagomirNC溶液/miR-146a组;于尾静脉分别注射0.1ml低表达外泌体miR-146a患者血浆外泌体浓缩液/无菌PBS溶液/miR-146a-NC溶液/miR-146aagomir溶液，每3天1次，一共6次。其中外泌体组为实验组，其对照组为PBS组;miR-146a组为实验组，其对照组为miR-146a-NC组。8周后处死裸鼠并解剖肝、肺进行HE染色。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证四组肝、肺miR-146a表达差异。 结果:（1）皮下移植瘤模型:注射28只裸鼠，成瘤27只，成瘤率为96.4％。4周后存活21只，分别为外泌体组5只，瘤体体积为0.09±0.057cm3;PBS组4只，瘤体体积为0.03±0.017cm3;miR-146a-NC组7只，瘤体体积为0.01（0.01，0.05）cm3;miR-146a组5只，瘤体体积为0.02±0.009cm3，四组裸鼠分组前瘤体体积差异无统计学意义（p=0.346）。9周后存活7只，1个瘤体样本由于同类相残丢失，最终收取瘤体样本20个。四组裸鼠皮下移植瘤瘤体体积分别为外泌体组5个瘤体，体积为0.588±0.527cm3;PBS组4个瘤体，体积为0.356±0.382cm3;miR-146a-NC组6个瘤体，体积为0.368±0.422cm3;miR-146a组5个瘤体，体积为0.106±0.068cm3。瘤体大小变化曲线显示，与对照组相比，外泌体组瘤体体积随时间增长速率呈增加趋势（p=0.172）;miR-146a组瘤体体积随时间增长速率明显缓慢（p=0.038）。HE染色显示瘤体呈CRC病理学表现。生存分析显示，与对照组相比，外泌体组裸鼠生存期呈现小幅度延长趋势（p=0.220）;miR-146a组裸鼠生存期呈现延长趋势（p=0.078）。免疫组化显示与对照组相比，外泌体组瘤体E-cadherin、Viemntin蛋白表达明显升高（p=0.014），N-cadherin蛋白表达呈现降低趋势（p=0.928）;miR-146a组E-cadherin、N-cadherin、Viemntin蛋白表达明显降低（p=0.000）。 （2）远处转移瘤模型:注射28只裸鼠，2周后处死的裸鼠肝脏大体显示转移瘤形成。3周后存活22只，外泌体组5只/PBS组4只/miR-146a-NC组7只/miR-146a组6只。8周后存活8只，最终收取肝脏样本22个，肺脏样本21个，一个肺脏样本由于同类相残丢失。HE染色显示裸鼠肝或肺组织见有CRC转移瘤病理学表现则为转移瘤存在。外泌体组转移率为80％（4/5只）;PBS组转移率为25％（1/4只）;miR-146a-NC组转移率为57.1％（4/7只）;miR-146a组转移率为33.3％（2/6只）。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，肝脏内miR-146a表达，外泌体组未见有明显差异（p=0.969），miR-146a组表达明显增高（p=0.010）。肺脏内miR-146a表达，外泌体组可见下调趋势（p=0.298），miR-146a组表达呈现增高趋势（p=0.283）。 结论:（1）通过皮下注射LoVo细胞，可以成功建立裸鼠CRC皮下移植瘤模型，为研究CRC作用机制提供动物实验基础。 （2）上调miR-146a表达可以在体内抑制裸鼠CRC移植瘤生长，具有延长生存期的趋势。高表达miR-146a可以下调N-cadherin、Viemntin、E-cadherin蛋白表达;低表达外泌体miR-146a可上调Viemntin、E-cadherin蛋白，说明miR-146a可能具有调控EMT标志物的作用。 （3）miR-146a在肝内富集，在肺内有富集趋势，上调miR-146a表达可能具有在体内抑制CRC细胞转移的能力，可为CRC远处转移和靶向治疗提供一定的理论基础。
NETL