摘要
目的:骨关节炎(OA)是最常见的运动系统疾病之一，是一种变性疾病，涉及由多种因素引起的进行性关节破坏。老化是OA发展的关键因素，但是，其发病机制依然复杂，尚未得到完全阐述。关节软骨退化，细胞衰老、滑膜炎症和表观遗传改变等都可能在OA的形成中起作用。众多病因中，氧化应激和活性氧(ROS)过高表达被报道是促使OA进展的重要因素，它们调节细胞内信号传导过程，可导致软骨细胞衰老和凋亡，细胞外基质降解以及滑膜炎症和软骨下骨功能障碍。此外，OA的发生和进展与巨噬细胞介导的炎症有关，活化的巨噬细胞在OA滑膜组织、滑液和外周血中极化为M1型，分泌广泛的炎性细胞因子和ROS，从而促进炎症的加重，而过量ROS的表达会驱动巨噬细胞向M1型极化。通过清除过量的ROS，减少巨噬细胞的M1型极化并促使巨噬细胞M2极化是治疗OA的一个重要途径。本课题通过简单的化学还原方法合成了Pt-Se杂化纳米酶，探讨其清除ROS和调控巨噬细胞极化的能力，以及其在体内和体外对骨关节炎的治疗效果。 方法:本研究分为以下四个部分。(1)Pt-Se杂化纳米酶的制备及表征。我们通过简单的化学还原方法合成了Pt-Se杂化纳米酶，通过透射电镜(TEM)检测Pt-Se纳米颗粒的形貌，高角度环形暗场扫描TEM(HAADF-STEM)和EDX-mapping对Pt-Se的结构和元素进行分析，动态光散射仪(DLS)检测了Pt-Se纳米颗粒的粒径。使用X射线衍射仪(XRD)分析Pt-Se纳米颗粒的晶体结构，紫外可见分光光度计(UV-Vis)对其进行表征。使用电感耦合等离子原子发射光谱仪(ICP-OES)检测Pt-Se中Pt和Se元素的含量。通过DPPH和T-AOC试剂盒检测其总抗氧化能力，电子顺磁共振(EPR)检测其清除·OH和O2·-的能力。(2) Pt-Se杂化纳米酶调控巨噬细胞的极化。使用LPS诱导M1巨噬细胞表型，将细胞分为RAW组、M1组、M1+Pt组、M1+Se组和M1+Pt-Se组。CCK-8试剂检测纳米颗粒的毒性，Calcein-AM/PI染色评估巨噬细胞的活力，DCFH-DA荧光探针检测巨噬细胞内ROS的含量，qRT-PCR检测巨噬细胞相关基因IL-1β，IL-6，iNOS，TNF-α，CD206和IL-10的表达情况，免疫荧光染色检测巨噬细胞相关蛋白iNOS和CD206的表达水平。(3) Pt-Se杂化纳米酶对骨关节炎软骨细胞的影响。将巨噬细胞条件培养基(CM)与软骨细胞共孵育，探讨Pt-Se对软骨细胞炎症的作用。将细胞分为五组:RAW-CM组、M1-CM组、M1+Pt-CM组、M1+Se-CM组和M1+Pt-Se-CM组。通过CCK-8试剂检测单纯的Pt-Se对软骨细胞的毒性，DCFH-DA荧光探针检测软骨细胞内ROS的含量，JC-1荧光探针检测线粒体膜电位的情况，Fluo-3AM探针检测细胞内钙离子水平，qRT-PCR检测软骨细胞相关基因IL-1β，IL-6，iNOS，MMP-3，MMP-13，ACAN和Col2A1的表达，免疫荧光染色检测软骨细胞相关蛋白MMP-13的分泌水平。(4) Pt-Se对大鼠体内抗炎作用的研究。我们通过切断SD大鼠前交叉韧带，于4周后成功构建大鼠体内OA模型。将动物分为五组:Control组（假手术组），OA组（手术+生理盐水），Pt组（手术+Pt NPs），Se组（手术+Se NPs），Pt-Se组(手术+Pt-Se)。分别给予SD大鼠双侧膝关节注射生理盐水，Pt NPs，Se NPs和Pt-Se，于第4周和第8周分别获得相应组的膝关节大体标本，对标本进行大体评分，对标本组织进行HE染色。 结果:(1) Pt-Se杂化纳米酶的制备及表征。TEM结果表明Pt-Se纳米颗粒形状为类球形，DLS结果显示Pt-Se纳米颗粒粒径大约为20 nm，通过XRD和UV-Vis验证了Pt-Se的成功制备。DPPH和T-AOC试剂盒检测结果表明Pt-Se具有良好的抗氧化能力，EPR结果显示Pt-Se能够有效的清除·OH和O2·-。(2) Pt-Se杂化纳米酶调控巨噬细胞的极化。CCK-8结果显示Pt-Se浓度在0～200 μg/mL时对巨噬细胞无明显毒性，且浓度为100μg/mL时巨噬细胞活力最好(P＜0.05)，活死细胞染色结果与CCK-8结果一致。DCFH-DA荧光探针染色结果显示Pt-Se能够明显降低巨噬细胞内ROS的水平。qRT-PCR结果显示，与PtNPs和Se NPs相比，Pt-Se能够明显下调M1型巨噬细胞相关基因IL-1β，IL-6，TNF-α和iNOS的表达，并上调M2型巨噬细胞相关基因CD206和IL-10的表达（P＜0.05）。免疫荧光染色结果显示，与PtNPs和Se NPs相比，Pt-Se能够明显抑制M1巨噬细胞相关蛋白(iNOS)分泌（P＜0.001），促进M2型巨噬细胞相关蛋白(CD206)的表达(P＜0.001)。(3) Pt-Se杂化纳米酶对骨关节炎软骨细胞的影响。CCK-8结果显示单纯的Pt-Se对软骨细胞无明显毒性，DCFH-DA荧光探针检测结果显示，与Pt NPs和Se NPs相比，Pt-Se能够明显降低软骨细胞内ROS的含量。JC-1结果表明，与Pt NPs和Se NPs相比，Pt-Se能够明显逆转线粒体去极化。Fluo-3 AM结果显示Pt-Se能够降低细胞内的钙离子水平。(4) Pt-Se对大鼠体内抗炎作用的研究。通过观察膝关节大体观并进行大体观评分，并进行组织的HE染色，结果表明Pt-Se杂化纳米酶能够减缓OA的进展。 结论:Pt-Se杂化纳米酶具有清除ROS的能力，能够降低巨噬细胞的M1极化并促使其M2型极化，通过关节腔注射进行体内OA治疗，发现Pt-Se能够很好的延缓OA的进展，这些为OA的临床治疗提供了新的治疗价值。
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