摘要
目的和意义:三阴性乳腺癌(TNBC)具有复发风险高，预后较差等特点，严重危害人们的生命和健康。基于纳米材料的光疗副作用小和预后良好等优点被用于TNBC治疗，但实体瘤内较高胶原蛋白密度和血管压力会严重阻碍纳米颗粒进入肿瘤细胞，降低其治疗效果。研究发现，氯沙坦(LST)-一种临床抗高血压药物，具有抑制胶原蛋白和血管生成，增强肿瘤渗透性的功能。本研究拟设计合成新型高渗透纳米载药系统(LST@IR820@PDA@CaCO3)实现超声(US)成像及光动力(PDT)/光热(PTT)协同治疗TNBC。 方法:①合成聚乙二醇(PEG)修饰聚多巴胺(PDA)纳米颗粒在原位实施CaCO3矿化法并通过静电吸附作用引入LST和光敏剂(IR820)构建近红外光(NIR)响应性纳米载药系统(LST@IR820@PDA@CaCO3)。通过核磁共振氢谱、傅里叶红外光谱、紫外光谱、透射电镜等对其理化结构和性质进行表征，使用分光光度-标准曲线法和高效液相色谱(HPLC)法分别测定LST@IR820@PDA@CaCO3中IR820和LST的包载率。②以溶血试验、CCK8实验、体内毒性试验评价纳米载体的生物相容性。③通过体外实验测试载药系统的性能和联合治疗效率:研究LST@IR820@PDA@CaCO3的释药行为，实施光热升温和光热循环实验测定LST@IR820@PDA@CaCO3光热转换效率和稳定性，使用DPBF和DCFH-DA探针测定LST@IR820@PDA@CaCO3在胞外和胞内的活性氧(ROS)生成能力并监测LST@IR820@PDA@CaCO3在体外酸性和中性环境的超声成像效果。④以4T1细胞为TNBC模型通过MTT实验、AM-PI活死细胞染色实验、凋亡实验测定LST@IR820@PDA@CaCO3在体外的PTT/PDT协同治疗效果。⑤在裸鼠胸部建立TNBC模型，观察LST@IR820@PDA@CaCO3在肿瘤部位的超声成像效果，并进行体内联合治疗实验评价药物的联合治疗效率，并通过对肿瘤切片进行免疫荧光染色探究LST在治疗中发挥的作用。 结果:①通过理化结构表征证实合成了聚多巴胺纳米载体PDA-GSH-PEG5k和纳米载药系统LST@IR820@PDA@CaCO3，并测得二者平均粒径分别为19.8 nm和43.2 nm。计算出LST@IR820@PDA@CaCO3中IR820的平均载药率(9.46％)和包封率(56.75％)以及LST的平均载药率(16.15％)和包封率(97.85％)。②PDA-GSH-PEG5k及PDA@CaCO3(0.05-0.5mg/mL)与血细胞共同孵育，溶血率均值皆低于2％; CCK8实验结果表明PDA-GSH-PEG5k和PDA@CaCO3(＜ 1.5 mg/mL)与293T细胞共同孵育24 h后的细胞活力都在80％以上，未表现出明显细胞毒性;体内毒性试验结果表明PDA-GSH-PEG5k对小鼠的生长发育无显著影响，无明显器官毒性。溶血试验、CCK8实验和21天毒性试验证明纳米载体的生物安全性良好。③LST在中性环境与酸性环境的24 h释药率无明显差异，且游离LST释放速率高于载药系统中的LST。光热实验中材料LST@IR820@PDA@CaCO3升温最高能提升30℃， 光热转换效率为37.68％， 表明LST@IR820@PDA@CaCO3在808 nm作用下具有优异的光热转化性能和良好的光热稳定性。 ROS产能评价实验中细胞内外LST@IR820@PDA@CaCO3+Light 组的 ROS 产量都明显高于LST@IR820@PDA@CaCO3组、 光照组和空白对照组， 表明LST@IR820@PDA@CaCO3能在808 nm光照刺激下产生充足的ROS。体外超声(US)造影实验可观察到同浓度LST@IR820@PDA@CaCO3溶液在酸性环境的超声造影效果优于在中性环境中的超声造影效果，提示载药系统有实现pH响应超声成像的潜能。④体外协同治疗:4T1细胞与LST@IR820@PDA@CaCO3 (0-0.5 mg/mL)共同孵育24 h后细胞活力仍在70％以上，未表现出明显细胞暗毒性;而LST@IR820@PDA@CaCO3 (0.5mg/mL)与4T1细胞在808 nm光照刺激后共同孵育24 h的细胞活力则低于20％，表明该浓度下LST@IR820@PDA@CaCO3在体外可以实施PTT/PDT联合治疗有效抑制4T1细胞生长;AM-PI实验结果表明LST@IR820@PDA@CaCO3+Light组4T1细胞几乎已经完全死亡，而对照组和LST@IR820@PDA@CaCO3组细胞生长状态良好;凋亡实验中LST@IR820@PDA@CaCO3+Light组的4T1细胞凋亡率为40.41％，明显高于对照组的4T1细胞凋亡率24.71％。MTT实验、AM-PI实验、凋亡实验证明了在体外LST@IR820@PDA@CaCO3能够通过PDT/PTT联合治疗抑制4T1细胞生长。⑤体内联合治疗肿瘤效率评价:体内超声成像实验中在注入LST@IR820@PDA@CaCO3后荷瘤小鼠肿瘤部位的超声成像信号明显增强。在尾静脉注射加808 nm光照治疗后IR820@PDA@CaCO3+Light组和LST@IR820@PDA@CaCO3+Light组荷瘤小鼠肿瘤表面温度能够达到63.6℃和64.9℃，明显高于其他组;14天治疗后这2组荷瘤小鼠的肿瘤生长都得到了明显抑制，LST@IR820@PDA@CaCO3+Light组肿瘤抑制更为明显，肿瘤切片的HE染色结果表明LST@IR820@PDA@CaCO3+Light组肿瘤细胞几乎已完全坏死，而其余治疗组与对照组的肿瘤抑制率和肿瘤细胞坏死率都较低;治疗组与对照组裸鼠的生长曲线与血生化血常规指标未见明显区别，器官HE染色未见明显损伤，证明LST@IR820@PDA@CaCO3有良好的体内联合治疗抗癌效果和生物安全性。免疫荧光染色实验结果显示LST@IR820@PDA@CaCO3组和LST@PDA@CaCO3组肿瘤部位的Collangen I和CD 31含量低于IR820@PDA@CaCO3组和对照组的肿瘤部位Collangen I和CD 31含量，提示LST在治疗过程中发挥了降低肿瘤部位压力，增强肿瘤渗透性的作用。 结论:本研究通过PEG修饰PDA纳米颗粒原位CaCO3矿化法合理设计并合成了具有超声造影功能的NIR响应性纳米载药系统(LST@IR820@PDA@CaCO3)。 LST@IR820@PDA@CaCO3通过PTT/PDT的协同肿瘤疗法有效抑制了荷瘤小鼠肿瘤生长。CaCO3纳米颗粒通过产生CO2气泡在酸性肿瘤环境中产生回声信号，表达稳定的超声成像功能。LST@IR82O@PDA@CaCO3表现出良好的生物相容性和对TNBC的优异的抗癌活性，因此可以成为具有潜力的用于TNBC的超声成像和临床治疗的纳米载药系统。
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