摘要
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)又称F-2毒素，是一种主要由镰刀菌属(Fusarium)产生的非甾体雌激素类真菌毒素，广泛存在于霉变的玉米、小麦和高粱等谷物及其副产品中，被动物吸收后易引起不孕不育、流产和死胎等病症，且其具有很强的致突变性、致癌性，严重危害牲畜及人类健康，亟需有效的控制处理方法。目前对ZEN的脱毒研究主要集中在生物防控领域，其中基于关键酶的催化作用，改变ZEN结构并使其转变为低毒小分子代谢物的生物转化方法成为研究中的重点。 本文针对自玉米田土壤样品中分离得到的菌株进行ZEN诱导培养，筛选得到一株高效降解ZEN的菌株，命名为YQ-1。YQ-1在发酵培养基（FB）的培养下，12h内对ZEN（20μg/mL）的降解率可达98.36%，生成分子式为C20H30O7的产物A和C30H43O15产物B，其中产物B推测为ZEN-二葡糖苷（ZEN-diG）。经形态学观察、16s rDNA和gyr A基因序列比对，构建系统发育进化树，菌种鉴定YQ-1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（保藏号GDMCC1.3763）。Bacillus subtilis YQ-1催化ZEN的关键作用酶细胞定位于细胞膜上。MCF-7细胞增殖实验表明，YQ-1催化ZEN生成的产物对MCF-7细胞增殖促进作用显著降低，有效脱除了ZEN的雌激素毒性。培养菌株YQ-1催化降解ZEN的最适条件包括：培养基额外添加葡萄糖浓度30mg/mL，50℃，pH范围为5.0-9.0；Cu2+对其活性有显著抑制效果，YQ-1在最适条件下对ZEN的降解率为99.07%。 基于产物B为ZEN-二葡糖苷（ZEN-diG），推测YQ-1中有糖基转移酶参与了ZEN的转化。本论文从Bacillus subtilis YQ-1中克隆到一个新的糖基转移酶基因yqgt（Genbank number:OQ845907），长933bp，编码一个311氨基酸的蛋白质，三维结构预测表明它属于GT-B家族，与枯草芽孢杆菌168的糖基转移酶Bs-YjiC具有92%的相似性。将基因yqgt插入表达载体，构建重组大肠杆菌E.coli BL21/pET-YQGT实现异源表达YQGT酶，HPLC和LC-MS结果表明，重组YQGT酶的具有催化ZEN糖基化活性，在37℃下反应48h，可将25.63%的ZEN（20μg/mL）转化为ZEN-diG。 根据降解酶的细胞定位，以ZEN降解率为指标，以丁醇提取得到的膜蛋白粗酶液（蛋白含量为9.86μg/mL，酶活为0.044U/mg）在12h内对20μg/mL ZEN的降解率为64.09%，被转化为HPLC保留时间2.5min的compound2（分子量383[M+H]+），与Bacillus subtilisYQ-1全细胞催化产物A一致。分析膜蛋白粗酶液的氨基酸序列，其中Lane1的P12序列与贝氏芽孢杆菌ANSB01E的α/β水解酶具有66.67%的相似性。粗酶液催化ZEN反应的最适条件：40℃，pH8.0，Na+、Ca2+、Mg2+和EDTA可促进酶活。 本论文从自然界分离、鉴定并保藏了一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis YQ-1，该菌于FB培养基培养12h可催化98.36%的ZEN（20μg/mL）转化生成雌激素毒性显著降低的产物A（C20H30O7）和产物B（C30H43O15）；一个新的糖基转移酶yqgt被克隆并验证为可催化ZEN转化生成产物B；用丁醇提取的Bacillus subtilis YQ-1膜蛋白酶液可催化ZEN转化成产物A。该论文筛选的枯草芽孢杆菌和克隆的糖基转移酶YQGT为ZEN的生物转化提供了新的研究来源，为挖掘催化ZEN关键作用酶、揭示其降解机理奠定了基础，丰富了芽孢杆菌属催化ZEN降解的相关研究。
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