摘要
背景和目的： 血吸虫病是一种危害仅次于疟疾的人兽共患寄生虫病，其虫卵导致的肝脏肉芽肿性炎症损伤及其导致的肝纤维化是血吸虫病的基本特征也是其致死的主要原因。针对血吸虫病的治疗有杀虫药物吡喹酮（praziquantel，PZQ），但是针对晚期血吸虫病导致的肝脏纤维化尚无有效方法。间充质干细胞具有显著的免疫调节作用，有研究发现MSC可以通过调节巨噬细胞极化发挥抗纤维化作用，但作用结果不尽一致，有发现MSC通过抑制M1极化发挥作用，另有发现是通过抑制M2；而且M1或M2巨噬细胞的划分只是反映了巨噬细胞的两个极端功能，并没有体现巨噬细胞在体内随肝纤维化发展的型别动态变化，而这一点正是肝纤维化精准干预措施最重要的环节。最近有研究发现根据单核细胞表面 ly6c 表达的高低，将单核细胞分为 ly6chi ,又被称为“炎性巨噬细胞”（inflammatory macrophages）和ly6clo“修复性巨噬细胞”（restorative macrophages）两个亚群，且ly6chi随着炎症进展可以变化为ly6clo型巨噬细胞，完成从促炎到抗炎的转化，从而抗纤维化。前期研究发现，IFN-γ和TLR4激活的间充质干细胞（MSCTLR4-ACTIVED）对治疗血吸虫性肝纤维化效果更好，那么MSCTLR4-ACTIVED是不是可以通过影响ly6chi转化为ly6clo型巨噬细胞发挥抗纤维化作用。因此，在血吸虫感染模型中，比较诱导的MSC组较未诱导的MSC组的治疗效果，研究MSCTLR4-ACTIVED是否通过促进ly6chi型巨噬细胞向ly6clo型转化发挥抗纤维化作用并对其作用机制进行探讨，为血吸虫病的临床治疗提供新思路。 方法： MSCTLR4-ACTIVED对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的治疗以及巨噬细胞型别的调节作用 腹部敷贴尾蚴，建立日本血吸虫感染小鼠模型，于感染后第6周给予吡喹酮（praziquantel，PZQ）连续灌胃杀虫治疗5天，感染后第7周分别给予MSCTLR4-ACTIVED和MSC治疗，观察MSCTLR4-ACTIVED对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的治疗效果1）对感染鼠体重的影响；2）对肝损伤的基本影响，包括肝指数、肝脏大体观察；3）对纤维化的影响，包括HE、MASSON染色病理观察及肉芽肿和纤维化定量分析、PCR检测(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col I)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)；4）炎症因子的分析，包括白细胞介素1 （IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）；基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMP)。初步表明并激活的MSC可减轻炎症因子，促进MMP和抑制TIMP。由于Ly6Clo型别的促修复型巨噬细胞被认为可通过表达MMP减轻肝纤维化，进一步对Ly6Chi 、Ly6Clo巨噬细胞亚群进行分析。为进一步阐明共激活的MSC是否通过调节单核巨噬细胞的型别转换介导抗纤维化作用，采用CCR2拮抗剂抑制骨髓来源单核细胞的趋化后，再观察对单核巨噬细胞型别的影响。 CCR2拮抗剂RS102895对MSCTLR4-ACTIVED治疗组小鼠肝脏纤维化及巨噬细胞型别的影响。 建立血吸虫感染小鼠模型后，在感染第6周进行PZQ治疗连续治疗5天后进行CCR2拮抗剂RS102895腹腔注射，连续注射5天，之后通过尾静脉注射MSCTLR4-ACTIVED，在治疗后第2周取材。观察RS102895抑制单核巨噬细胞趋化后对MSCTLR4-ACTIVED治疗日本血吸虫感染小鼠纤维化的影响，分别比较各组体重变化；收集肝脏组织；通过制作病理切片观察小鼠肝脏纤维化的病理变化情况；流式细胞术观察肝脏Ly6Chi与Ly6Clo型巨噬细胞的转变情况。 结果： MSCTLR4-ACTIVED治疗显著减轻了日本血吸虫感染小鼠肝纤维化。 研究发现研究发现MSCTLR4-ACTIVED能够减少血吸虫病肝脏虫卵肉芽肿和肝纤维化的面积；降低平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)等纤维化基因的表达；降低白细胞介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）等炎症因子的表达；升高基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)，降低基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMP)的表达来促进细胞外基质的讲解。流式细胞分析发现， MSCTLR4-ACTIVED治疗后第二周使Ly6Clo亚群巨噬细胞显著升高，在采用CCR2拮抗剂抑制骨髓来源单核细胞的趋化后Ly6Clo亚群巨噬细胞显著降低。 CCR2拮抗剂RS102895对于MSCTLR4-ACTIVED治疗组小鼠肝脏纤维化及巨噬细胞型别的影响。 MSCTLR4-ACTIVED+RS102895组较MSCTLR4-ACTIVED治疗组小鼠肝脏质地硬、表面有大量细小点状凸起如，且减弱了MSCTLR4-ACTIVED组对于肝脏指数（肝脏重量/小鼠体重）的下调作用，说明RS102895抑制单核巨噬细胞趋化能够减弱MSCTLR4-ACTIVED治疗对于肝脏大体形态的转变和肝脏指数的减少作用；流式细胞术检测发现MSCTLR4-ACTIVED+RS102895组较MSCTLR4-ACTIVED组肝内Ly6Clo亚群细胞比例明显降低。 结论： 1、MSCTLR4-ACTIVED治疗能够减轻日本血吸虫感染小鼠肝脏内虫卵肉芽肿及纤维化病变；同时单核巨噬细胞呈现从第一周Ly6Chi亚群升高到第二周修复型Ly6Clo CX3CR1+CCR2+亚群显著升高的动态变化。 2、采用CCR2拮抗剂抑制单核巨噬细胞的趋化后，MSCTLR4-ACTIVED治疗组加剧纤维化的发展，同时巨噬细胞不仅Ly6Chi亚群有所降低，尤其修复型Ly6Clo CX3CR1+CCR2+亚群细胞显著减少。由此提示激活的MSC可能通过调节单核巨噬细胞的型别转化影响血吸虫肝纤维化发展。
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