摘要
构建体外多酶体系是实现复杂生物化工合成的一种绿色高效途径。基于固定化策略开发多酶生物催化剂对提高酶的稳定性和回收率至关重要。在传统多酶无序共固定体系中，中间体累积会抑制级联反应效率；同时多酶之间的相互作用也会干扰催化进程。有序的多酶分隔化分布有助于优化底物的运输通道，促进级联反应有序可调地进行。沸石咪唑酯骨架材料（Zeolitic imidazole frameworks, ZIFs）具有比表面积大、孔道可调节、稳定性高及可仿生矿化等特点，作为生物催化剂的固定化载体已广泛应用。核-壳ZIF@ZIF具备双层结构，其天然的层状和孔状结构赋予了固定化酶合适的分布顺序和距离。需要指出，ZIFs 的微孔结构限制了酶与底物的相互接触，常需要通过扩大孔径的途径来提高固定化酶的催化效率。在保证底物传质速率的基础上，合理调控多酶在载体限定空间内的分布，开发分隔式多酶生物催化剂，对优化多酶协同催化作用及促进级联生化反应进程具有重要理论研究及应用意义。 论文设计了一种简单通用的合成策略，分别将葡萄糖氧化酶（ Glucose oxidase, GOx）和辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）定向分布在ZIF-8@ZIF-8纳米结构的核与壳中，构建出分隔式多酶生物催化剂。同时，基于石胆酸（Lithocholic acid, LCA）与原有机配体2-甲基咪唑（2-Methylimidazole, 2-MeIM）的竞争机制，调控ZIFs微孔结构。研究成果将为体外多酶生物催化剂的合成提供新的便捷途径，并为生物化工合成新工具的开发应用提供理论指导。主要研究内容和结果如下： 1、分层次微/介孔的载酶ZIF-8纳米颗粒的制备及表征。采用仿生矿化法，在温和条件下将GOx酶分子固定于ZIF-8骨架中，同时加入LCA，制备出负载GOx的分层次微/介孔ZIF-8（GOx/hierarchical micro- and mesoporous ZIF-8, GOx/HM-ZIF-8）纳米颗粒。采用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱仪（XPS）、热重分析（TGA）、孔径分布和比表面积分析（BET）等现代分析手段进行验证和表征，结果表明：LCA和GOx可成功负载于ZIF-8纳米颗粒；加入LCA后颗粒介孔比例显著增加，总平均孔径从1.75 nm增加到1.81 nm。固定化酶的催化性能和稳定性的研究结果表明：在最大酶载量和稳定性一致时，经 LCA 改性后固定化酶的酶活保留率从33.48%提升到49.06%。 2、基于核-壳ZIF@ZIF纳米结构的GOx/HRP分隔式双酶生物催化剂的构建、表征及壳层生长机制研究。以 GOx/HM-ZIF-8 为内核，通过诱导成核策略实现晶体外延生长，同时加入 HRP 获得均匀包覆在内核表面的载酶 ZIF-8 外壳，使双酶分子均匀分隔于外壳和内核中。同步加入 LCA 实现核、壳孔径的增加。采用场发射扫描电子显微镜、透射电子显微镜、CLSM、XPS、BET 等现代分析手段进行验证和表征。结果表明核-壳纳米结构成功形成，可实现双酶分隔化分布，壳层的外延生长遵循与酶的包封同步进行的机制。调整双酶位置和ZIFs种类，发现双酶位置可实现互换，且分布不受ZIFs种类影响，证明该构建策略具有普适性。分隔式双酶催化性能和稳定性研究结果表明：核-壳ZIFs骨架为分隔式双酶提供了稳定的构型，壳层最大酶载量可达9.26 mg g-1，且GOx/HRP最佳质量比为2:3。 3、核-壳分隔式双酶结构影响级联催化效率机制的研究。（1）核壳孔径的影响：研究经不同浓度LCA改性得到的核壳孔径对级联催化效率的影响，当LCA添加浓度均为5 mM时，4-14 nm介孔比例达到最大，总平均孔径从1.60 nm增加至1.68 nm，级联催化效率可提升4.5倍；（2）双酶组装位置的影响：研究不同双酶组装位置产生的级联催化效率差异，发现GOx/HM-ZIF-8@HRP/HM-ZIF-8和HRP/HM-ZIF-8@GOx/HM-ZIF-8对级联反应中间体H2O2的利用率差异显著，分别为70.25%和41.92%，表明HRP位于壳层时可更有效地接触和捕获H2O2分子。
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