摘要
目的：家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia，FH)是一种常染色体(共)显性遗传病，主要是由于低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor， LDLR)参与的胆固醇代谢过程中所涉及的相关基因发生致病性突变所致。FH患者主要的临床表现为低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)升高与早发的动脉粥样硬化性心血管疾病。虽然FH比普通的高胆固醇血症的发病率低，但我国人口基数大，存在大量潜在患者。并且FH的临床危害性较普通的高胆固醇血症大得多。其中LDLR基因为FH最常见的致病基因，但目前仅对其中极少数突变进行了功能研究。本研究旨在研究临床上发现的LDLR基因突变位点的细胞生物学功能，为更好的明确FH病因、完善突变分类、完善FH的临床诊断标准进而找出FH的治疗靶点。 方法：1. FH先证者及家系调查：根据荷兰脂质临床网络(Dutch Lipid Clinic Network，DLCN)评分标准收集评分＞8分的FH患者并调查家系，将先证者者的血样进行全外显子测序。2. 基因分析：通过生物信息学分析、文献资料调查等综合预测并筛选出可能的FH致病突变位点后，使用Sanger测序验证先证者及其家系中的相关突变。3. 建立突变位点和野生型的细胞模型：利用人HEK293T细胞，外源性导入装有目的基因的质粒载体，通过荧光定量PCR、Western Blot来检测其LDLR表达。4.明确突变基因的细胞生物学功能：将外源性加入带有荧光标记的Dil-LDL与构建的细胞模型共同孵育，用激光共聚焦显微镜探测LDLR摄取 LDL能力。5.初步明确变异LDLR的细胞生物学定位：采用流式细胞术、细胞免疫荧光技术检测细胞膜上LDLR的表达与细胞器定位。 结果：1.本研究共纳入3名FH患者及其家系，通过全外显子筛选出LDLR可能的致病突变基因：LDLR c. G1864A、LDLR c. G292A、LDLR c. G1448A、LDLR c. T599G，并通过Sanger测序加以验证。其中，LDLR c. G1864A、LDLR c. G292A为在同一先证者中发现的两个不同的突变位点。2.生物信息学分析：LDLR c. G1448A为无义突变(nonsense mutation) ，使氨基酸第 483位色氨酸变成终止密码子(LDLR p. W483*)；LDLR c. G1864A、LDLR c. G292A、LDLR c. T599G为错义突变(missense mutation)，分别为第622位氨基酸从天冬氨酸突变为天冬酰胺(LDLR p. D622N)，第98位氨基酸从丝氨酸突变为甘氨酸(LDLR p. G98S)，第200位氨基酸从苯丙氨酸突变为半胱氨酸 (LDLR p. F200C)。3. 突变位点对LDLR表达的影响：LDLR c. G292A对LDLR蛋白的表达影响与野生型比变化较小；LDLR c. G1864A表达成熟LDLR蛋白较野生型组显著下降，表达前体LDLR蛋白较野生型显著增多；LDLR c. G1448A、LDLR c. T599G表达LDLR蛋白较野生型显著减少。4. 突变影响LDLR与LDL-C的生物结合力：所有LDLR突变型对LDLR与LDL-C的生物结合力均较野生型下降，其中无义突变LDLR c. G1448A的LDLR与LDL-C的生物结合力相对野生型降低最多。5. 所有突变型的细胞膜上表达LDLR较野生型均下降并具有统计学意义。与野生型相比，LDLR突变型被滞留于内质网并堆积，而在细胞膜上减少。 结论：LDLR 在G1864A、G292A、G1448A、T599G四个位点上发生突变均影响LDLR的正常生物学功能，降低LDL-C代谢能力，导致家族性高胆固醇血症发病。
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