摘要
缢蛏（Sinonovacula constricta）是我国四大养殖贝类之一，具有重要的经济价值和养殖效益。性腺发育是发育生物学的热点研究领域之一，国内外学者已将性腺发育相关理论应用到水产经济动物遗传育种中，获得个体大、生长速度快、繁殖力强、肉质品质好的养殖群体，然而双壳贝类性腺发育机制还不清楚，相关研究仍比较薄弱，对贝类新品种培育、健康养殖产业持续发展十分不利。本研究以缢蛏为研究对象，通过雌、雄性腺转录组、蛋白组、代谢组联合分析筛查性腺发育相关基因、蛋白及代谢物；克隆获得性腺发育相关基因的cDNA全长序列并进行序列分析；利用qRT-PCR、免疫荧光技术分析了关键基因在性腺发育周期中的表达模式和细胞定位；分析了siRNA干扰和慢病毒过表达对关键基因表达的影响，探讨了其在缢蛏性腺发育过程中的作用。本论文初步解析了贝类性腺发育的调控机制，为贝类生殖调控技术的发展奠定理论基础。主要研究结果如下： 1. 在缢蛏雌、雄性腺转录组学分析中，共筛查到了44个性腺发育相关基因，包括性别决定、性腺发育基因Dmrt4/5-1、Sox9、Fem-1b、Fem-1c和 Beta-catenin等，以及参与配子发生、发育的基因Vg、CYP17A1、TSSK 等；在缢蛏雌、雄性腺蛋白组学分析中，共鉴定出1462个差异蛋白，筛查到43个可能与性腺发育相关的差异蛋白，在精巢中显著上调的有SPGT2、Tektin家族蛋白、TSSK家族蛋白等，在卵巢中显著上调的主要有17β-HSD12、Cytochrome P450、Beta-catenin等；从缢蛏雌、雄性腺代谢组中共鉴定了409个差异代谢物，其中尿苷在雌性卵巢中极显著上调，具有作为性别差异代谢标志物的潜力；鉴定了与性腺发育相关的23个差异代谢物，在精巢中显著上调的16,16-二甲基前列腺素A2、孕酮、亮氨酸、脯氨酸、精氨酸等，在卵巢中显著上调的有孕烯醇酮、甲基睾酮等。转录组和蛋白组联合分析共同鉴定出618个差异基因/蛋白，其中表达趋势一致的共有485个，筛选出22个与性腺发育相关的差异基因/蛋白，获得了性腺发育相关的mTOR信号通路、Notch信号通路等；转录组和代谢组共同关联的KEGG通路共有31个，与性腺发育相关的有类固醇生物合成通路等；蛋白组和代谢组联合分析中，差异蛋白和差异代谢物共同富集的KEGG通路共有11个。本研究筛选到的差异基因/蛋白/代谢物及代谢通路将为深入解析缢蛏性腺发育机制奠定理论基础。 2. 缢蛏ScSox9基因的开放阅读框（ORF）1458bp，编码485个氨基酸，编码蛋白含有Sox蛋白家族保守结构域HMG框，表现出高度保守性；ScSox9基因在缢蛏各个组织中均有表达，在精巢中的表达量显著地高于卵巢（P＜0.05）；ScSox9基因在缢蛏雌、雄性腺增殖期、生长期、成熟期和排放期均有表达，且在精巢中的表达量均显著高于同期卵巢（P＜0.05）。ScSox9基因在精巢生长期表达量最高，在卵巢各个时期表达水平均较低且无显著差异。缢蛏ScSox9蛋白主要定位在雌、雄性腺各个发育时期的生殖细胞中，如卵巢的卵原细胞、卵母细胞及成熟卵细胞中，精巢的精原细胞、精母细胞和成熟精子中。siRNA干扰后，ScSox9基因在精巢、卵巢中的表达量均极显著下降（P＜0.01），说明siRNA干扰的有效性；慢病毒过表达后，ScSox9基因在雌、雄性腺中的表达量均极显著升高（P＜0.01），表明构建的慢病毒过表达载体可有效过表达ScSox9基因。综合表明，ScSox9基因可能参与了两性性腺发育及成熟，但在精巢的作用要高于卵巢，主要参与精巢的发育和精子发生。 3. ScFem-1b、ScFem-1c基因ORF序列分别为1911bp和2035bp，编码636、622个氨基酸。ScFem-1b 蛋白的氨基酸序列包含 6 个典型的锚定蛋白重复序列 ANK，而 ScFem-1c 蛋白含有 7 个典型的锚定蛋白重复序列 ANK，二者均具备 Fem 家族典型的保守结构域。ScFem-1b、ScFem-1c基因在缢蛏不同组织中均有表达，在精巢中的表达量均显著高于卵巢（P＜0.05）；ScFem-1b 基因在精巢成熟期表达量最高，而 ScFem-1c 基因在精巢生长期表达量最高，均在卵巢发育各个时期表达量较低且无显著差异。ScFem-1b 和 ScFem-1c蛋白均定位在卵巢中的卵原细胞、卵母细胞及成熟卵细胞的细胞质中及精巢中的精原细胞、精母细胞、精细胞及精子细胞中。siRNA 干扰后，ScFem-1b 和 ScFem-1c 基因在精巢、卵巢组织的表达量均极显著下降（P＜0.01）；慢病毒过表达后，ScFem-1b 和 ScFem-1c基因在雌、雄性腺中的表达量均极显著升高（P＜0.01）。研究结果表明ScFem-1b基因可能在精巢功能维持和精子排放中发挥了重要作用，而 ScFem-1c 基因在精巢早期发育及精子发生过程中发挥着重要的作用。 4. 缢蛏ScDmrt4/5-1 和ScDmrt4/5-2基因的ORF序列分别为1170bp、1125bp，编码389、374个氨基酸，编码的蛋白均具备DM和DMA保守结构域；结合氨基酸同源序列比对和系统进化树分析，可将缢蛏2个Dmrt基因确定为Dmrt4/5-1和Dmrt4/5-2。ScDmrt4/5-1、ScDmrt4/5-2 基因在缢蛏各个组织中均有表达，在精巢中的表达量显著高于卵巢（P＜0.05 ）。ScDmrt4/5-1 基因在精巢成熟期表达量最高，在卵巢排放期中表达量最高；ScDmrt4/5-2 基因在精巢成熟表达量最高，在卵巢各发育时期表达水平较低且无显著差异。ScDmrt4/5-1 和 ScDmrt4/5-2 蛋白均主要定位在雌、雄性腺各发育时期的生殖细胞中，在卵巢的卵原细胞、卵母细胞和成熟卵细胞中及精巢的的精原细胞、精母细胞、精细胞及精子中均有表达。研究结果表明 ScDmrt4/5-1、ScDmrt4/5-2 可能主要参与了精巢的发育及功能维持。
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