摘要
随着全国工业化、城市化以及农业现代化的飞速发展，土壤重金属污染日趋严重。土壤重金属会通过食物链在人体内富集，将严重危害人类健康，是致癌的潜在风险因素之一。植物修复具有环境友好、经济高效、且一定程度上能够增加土壤肥力等优点，在治理重金属污染土壤已受到了社会广泛关注。烟草（Nicotiana tabacum）是一种能够超富集重金属 Cd 的非粮食经济作物，采用烟草治理土壤 Cd 污染也是未来研究的热门方向之一。SQUAMOSA promoter binding protein-like (SPL)家族基因在调节植物生长发育、次生代谢产物合成和抗逆性等方面发挥着重要作用。然而目前对于 SPL 家族在烟草中的发挥的生物学功能了解依然有限。本研究基于生物信息学、转录组学以及分子生物学技术解析转录因子NtSPL4a调控烟草应答Cd胁迫的分子机制研究，取得以下研究结果： 1. 烟草 NtSPL 家族成员全基因组鉴定及表达模式分析 通过生物信息学方法在烟草栽培种TN90中鉴定出42个含有SBP结构域的NtSPL基因。SBP保守基序和系统发育树结果显示，烟草NtSPL基因家族可分为8个亚组，同一亚组的基因具有相似的motif和基因结构。启动子顺式作用元件分析结果表明，NtSPL基因能够受到植物激素和外界胁迫的调控。此外，PsRNATarget 预测结果显示，烟草NtSPL 家族成员中有 28 个基因能够受到 Nta-miR156 的靶向调控。转录组数据和烟草NtSPL基因家族组织表达谱数据表明，烟草NtSPL基因家族在烟草根、茎、幼叶、老叶和花等组织中有着不同的表达模式，其中NtSPL2a/3a/4a在烟草老叶和幼叶中表达水平较高，NtSPL6a仅在烟草的根和花中进行表达，而NtSPL10a/15a/17a在烟草老叶中的表达水平相对较低。造成组织表达模式差异的原因可能与 Nta-miR156 在不同组织中表达水平相关，这些结果暗示 Nta-miR156-NtSPL 表达调控模式在烟草生长发育中发挥重要作用。Cd胁迫下qPCR数据结果显示：Cd胁迫可显著诱导Nta-miR156的表达，而烟草NtSPL4a 的表达模式与 Nta-miR156 的表达模式呈现明显相反的趋势，暗示 miR156-NtSPL4a可能介导了烟草对Cd胁迫的响应。 2. 过表达 NtSPL4a/NtSPL4aΔ 对烟草耐受 Cd胁迫的影响 亚细胞定位结果显示，烟草NtSPL4a定位于细胞核，这与 SPL家族成员是转录因子的事实相吻合。同时，通过本氏烟瞬时共转化Nta-miR156和NtSPL4a/NtSPL4aΔ实验，证实了具有Nta-miR156结合位点的NtSPL4a基因能够受到烟草Nta-miR156的调控，而不含3’UTR（含有Nta-miR156结合位点）的NtSPL4aΔ基因的表达水平不受到烟草Nta-miR156的表达抑制。过表达NtSPL4a/NtSPL4aΔ烟草生长周期和野生型植株表型存在着一定差异，其中包括过表达烟草生长发育快、早花早育以及侧根发达等。此外，过表达植株中Cu和Mn的含量显著升高；Fe和Zn的含量显著降低。过表达烟草植株也会导致烟草中各种代谢物（脯氨酸、总酚、总黄酮、可溶性糖和淀粉等）的含量发生显著变化。为了考察 NtSPL4a 对应答 Cd 胁迫的作用，采用 50 μM Cd 胁迫下叶盘法测定了过表达NtSPL4a和NtSPL4aΔ烟草叶片中的Cd的含量，结果显示过表达植株中Cd含量显著低于对照组，且过表达NtSPL4aΔ烟草植株中Cd含量最低。说明在Cd胁迫下，过表达NtSPL4a能够降低植株中重金属Cd的含量，从而增强了转基因烟草对Cd的耐受性，并且该表型变化可能受到Nta-miR156调节。 3. 基于转录组学分析过表达 NtSPL4a 对 Cd胁迫应答基因表达的影响 为进一步解析NtSPL4a在烟草应答Cd胁迫的分子机制，采用RNA-seq对WT和过表达NtSPL4a/NtSPL4aΔ转基因烟草进行转录组测序。其中WT与过表达NtSPL4a之间存在183个差异基因，而与过表达NtSPL4aΔ共有594个差异基因。GO富集分析显示富集到分子功能的差异表达基因主要与生长发育、转运蛋白活性、抗氧化活性和信号转导活性等相关。KEGG富集结果显示差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、氨基酸和黄酮类生物合成以及半胱氨酸合成代谢等通路。WT和过表达NtSPL4a/NtSPL4aΔ转基因烟草共有 66 个显著差异表达基因，包含转录调控、生长发育、重金属胁迫响应、抗氧化酶系统以及光合色素酶系统相关的 5 类生物学功能。通过 qPCR 验证了过表达NtSPL4a/NtSPL4aΔ烟草中 8 个差异表达基因的表达水平，结果显示均能和转录组数据相吻合。为进一步研究转录组差异基因表达是否受Cd胁迫的影响，采用qPCR分析了其中8个关键差异表达基因，结果显示上述8个基因的表达水平均显著受到Cd的诱导。基于Cd抑制NtSPL4a表达以及RNA-seq的结果，推测NtbHLH63（LOC107766787）等5个基因可能受到NtSPL4a的直接/间接调控。为证实这一假设，构建酵母单杂系统证实了NtSPL4a转录因子可以与NtbHLH63启动子上D1区域进行特异结合，从而靶向调控烟草NtbHLH63的表达水平。 综上所述，NtSPL基因家族成员NtSPL4a显著受到Cd胁迫的抑制，并且受到Nta-miR156的直接调控。过表达NtSPL4a缓解转基因烟草Cd毒性主要通过调节Cd的吸收与转运、维持活性氧内稳态等方面，可能的分子机制是 NtSPL4a 直接/间接调控下游转录因子（如NtbHLH63）或结构基因的表达。本课题为深入研究NtSPL家族基因的生物学功能奠定了基础，并为进一步解析转录因子NtSPL4a介导烟草应答Cd胁迫的分子机制提供新思路。
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