摘要
γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）能催化γ-谷氨酰基从供体化合物转移到受体上，广泛存在于动植物和微生物中。在目前食品酶制剂市场需求旺盛和大健康的背景下，GGT在食品功能因子等各种生物活性物质的生物绿色制造表现出较大的工业应用潜力。GGT的制备方法主要为原核微生物合成表达。但大肠杆菌表达外源蛋白易形成包涵体分泌到周质空间；而枯草芽孢杆菌作为GRAS宿主细胞，蛋白可胞外分泌表达，是GGT表达生产理想宿主。GGT酶法合成活性产物在实现产业化仍有困难，原因在于其在枯草芽孢杆菌系统中生产水平仍然较低，导致酶价格高；在食品酶制剂生产中仍然存在抗生素滥用和耐药菌形成的现象，因而需要解决使用抗生素标记带来潜在污染风险的问题；使用液体酶难以回收从而造成浪费和成本提高。因此，针对枯草芽孢杆菌表达系统与GGT生产及应用过程存在的问题，本论文选取了枯草芽孢杆菌GGT（BsGGT）、解淀粉芽孢杆菌GGT（BaGGT）、地衣芽孢杆菌GGT（BlGGT）三种不同来源的GGT基因进行系统的比较和优化调控元件，并基于CRISP/Cas9n及AID基因组编辑技术，探索在枯草芽孢杆菌中构建无抗性标记、高效表达目的蛋白的工具；研究制备GGT的环氧树脂载体固定化技术，应用于催化茶氨酸高效合成。主要研究结论如下： （1）为寻找性能优良的GGT，通过氨基酸序列、二级结构和三维结构的生物信息学对比分析，显示三种GGT的大小亚基的空间结构具有较大程度的重合性，信号肽差异最明显，功能上差别微小。在枯草芽孢杆菌ATCC6051-5中表达，酶活力测定及可溶性预测均为BlGGT最高。BsGGT和BlGGT的最适温度在60℃，而BaGGT在55℃。BsGGT、BaGGT和BlGGT的最适pH分别为10、8和9，表现出良好的耐热耐碱性。三者的转肽活性均随盐浓度的增大而增强，具有耐盐性。 （2）为提高异源蛋白的表达，比较了两种表达宿主对于GGT的表达和积累效果，选择枯草芽孢杆菌ATCC6051Δ5。将不同来源但类型相同的强启动子Pcd和P43重组，克服了相同启动子串联易重组的缺点。将不同信号肽进行组合，最终双启动子双信号肽Pcd-P43-SamyQ-SBsGGT比P43-SamyQ提高了63.43%的酶活性。 （3）由于CRISPR/Cas9n编辑质粒过大难以转化至枯草芽孢杆菌，通过添加PEG6000和海藻糖能改善此问题；缩短DSB位点两边上下游同源修补片段的间距及延长培养时间能有效提高长片段基因组整合的效率。BlGGT三拷贝整合至宿主基因组中表达，摇瓶发酵获得0.97U/mL酶活。过表达五种信号肽酶，其中SipS效果最显著，提高了12.82%。使用AID编辑技术建立快速无抗性标记质粒构建的方法可实现GGT高效表达，摇瓶发酵产酶酶活达53.65U/mL，相比于基因组整合三拷贝提高了54.31倍，与传统有抗性标记质粒表达相比产量相当。 （4）为提高酶的重复利用率，使用环氧树脂固定化BlGGT。经工艺优化，相比未优化前，固定化效率提高2.05倍，单位酶活提高2.62倍，最终获得68.85%的固定化效率和3.15U/g的酶活。该固定化酶重复使用十次仍能保持82.80%的酶活，且在4℃贮藏两个月后酶活剩余87.36%，相比游离酶更加稳定，具有便于保藏和可回收重复利用的优势。经探索，固定化酶合成茶氨酸的最佳的条件：pH9，37℃，200rpm，0.5U/mL酶，7h，获得最高转化率65.38%。
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