摘要
昆虫的视觉器官一复眼和单眼是昆虫进化过程中面对特定的视觉挑战和生态需求出现的精妙特殊结构，是视觉的结构基础。其中，复眼是昆虫主要的视觉器官，单眼是视觉的辅助器官，它们的结构变化对视觉形成具有重要作用。在昆虫的视觉形成机制中，视蛋白是决定因子之一，它同发色团（11-顺式视黄醛）结合并在光照的作用下发生变构与发色团脱离而激活，然后在G蛋白的介导下，激活激酶C引发后续通路，最终将信号传给中央脑中枢，发出视觉反应信号。已有研究结果显示，果蝇NinaE是视蛋白家族中的一种，NinaE的缺失和突变都会导致视网膜变性，该基因的突变还会影响R1-R6感光细胞的发育和光敏性。 本研究首先通过扫描电镜、HE切片、透射电子显微镜等技术对鳞翅目昆虫家蚕的单眼和复眼进行了外部形态和内部形态的观察;然后通过生物信息学分析对家蚕基因组中的视蛋白进行了鉴定，并进一步对它们的时空表达模式进行了检测，最后选择果蝇NinaE在家蚕中的同源基因Bmcop、Bmopsin1进行了原核表达、亚细胞定位、基因敲除，对它们的功能进行了探究。获得主要结果如下所示: 1.家蚕幼虫单眼的结构 家蚕幼虫的单眼分布在家蚕头部颅侧板两侧，每侧各有6个。每个单眼外部隆起呈半球形，直径约为80μm，主要结构包括角膜、角膜细胞、玻璃体、晶体、网膜细胞、瞳孔和视神经。 2.家蚕蛹期复眼发育 在蛹1d时，可以明显看到复眼的眼盘，夹在口器和触角之间。眼盘表观上被犁沟分为前部、分化中心和后部三个部分。从蛹1d-蛹8d,复眼着色逐渐加深，且眼盘前部、分化中心和后部之间的界限越发明显;蛾期时复眼全部着色，复眼各区域未能观察到明显区别。通过HE切片对蚕蛹1d-8d至蚕蛾期复眼的发育过程进行观察，结果显示复眼中首先发育的是角膜和晶锥，其次是色素细胞、基膜、视叶和视杆。基膜和视叶先于视杆发育，但是全部结构形成落后于视杆，视杆形成后，基膜和视叶分开，视觉神经最后发育。 3.蚕蛾复眼结构 首先通过扫描电镜对蚕蛾复眼进行了表观观察，蚕蛾复眼呈半球形，半径约为580μm，分布在头部两侧，一只复眼大概含有3000多只小眼。然后利用透射电子显微镜（TEM）对复眼进行40μm、200μm、400μm三个深度的横切和居中纵切。结果显示，蚕蛾复眼中的小眼基本结构从外至内依次为:角膜、晶锥、色素细胞、透明区、感杆束、基膜、视叶。角膜位于最外层，是一个约50层几丁质薄层的结构，角膜下方是晶锥束，由4-5个晶锥细胞组成，周围由两个大初级色素细胞包围，晶锥下端的色素颗粒由次级色素细胞组成，基本遍布整个小眼结构，主要集中在晶锥末端和感杆束顶端。感杆束之间由微管形成的绒毡层隔开，其主要结构是10个视网膜细胞，呈“9+1”式排列，视网膜细胞形成感杆，在感杆顶端细胞核区融合成一个大的感杆束，感杆束下方为基膜和视叶。 4.家蚕视蛋白基因的生物信息学分析及鉴定 已知昆虫的视蛋白分为LW（Rh6）、UV（Rh5）、blue（Rh4）、Rh7、c-opsin五大类，通过生物信息学分析在家蚕基因组中鉴定出6个视蛋白基因，其中2个基因属于Rh6视蛋白;其余四个基因分属于Rh5、Rh4、Rh7、c-opsin四个类群，将6个视蛋白基因与其他昆虫视蛋白构建进化树，结果与前面分析一致，XP_037871704.1和XP_037871515.1与果蝇NinaE和秋赤晴LW视蛋白聚在一支,家蚕KWMTBOMO05053与果蝇Rh7视蛋白聚在一支，家蚕XP_028030904.1与东方虎凤蝶Rh5（UV）视蛋白聚在一支，XP_004932925.1与棉铃虫blue视蛋白聚在一支，XP_021205037.1与冈比亚按蚊c-opsin视蛋白聚在一支。根据它们在NCBI的注释和分属类群，将家蚕中的Rh6类群的两个视蛋白基因分别命名Bmcop、Bmopsin1,Rh5类群的视蛋白基因命名为Bmrh5,Rh4类群的视蛋白基因命名为Bmrh4,Rh7类群的视蛋白基因命名为Bmrh7,c-opsin类群的视蛋白基因命名为Bmc-opsin。其中两个家蚕Rh6类群视蛋白基因是果蝇NinaE的同源基因，都位于家蚕第15号染色体上，为跨膜蛋白，含7个跨膜结构，且2种蛋白均未预测到明显的信号肽序列，2种蛋白均含有7tm1结构域，进一步对这两个基因进行了克隆鉴定并继续进行功能研究。 5.家蚕视蛋白的表达模式和Bmopsin1和Bmcop的定位分析 使用RT-PCR对所鉴定的6个视蛋白基因在家蚕大造品种不同时期和五龄三天组织中的表达模式进行了检测，结果显示:Bmcop、Bmopsin1和Bmrh5在蚁蚕-上簇2d时期均有少量表达。在蛹期1-8d和蛾中，不论雌雄，Bmcop在各时期头中有少量表达，在蛹身和蛾身中没有表达;Bmopsin1在各时期头中表达量逐渐升高，尤其在蛹7、8d和蛾头中高量表达，在蛹身和蛾身中基本没有表达;Bmrh4在雌蛹7-8天和蛾头中有微量表达，雄蛹中没有表达;Bmrh5在蛹后期的雌雄蛹头和蛾头中均有微量表达。在胚胎期，除了Bmcop在胚胎2h-5d少量表达，在6d-8d高量表达，且表达量随发育时间逐渐升高;其他三个基因在胚胎期没有表达。 在家蚕五龄三天各组织中，除了Bmopsin1在精巢中有较高量表达以外，其他三个基因基本在各组织中没明显表达。此外，经克隆测序分析验证Bmrh7在蛾头中有较高量表达;Bmc-opsin在家蚕各发育时期和组织中未见检测到表达。细胞水平上检测显示，在BmN-SWU1细胞中，Bmcop在细胞核中无明显表达，在细胞质中有表达;Bmopsin1在细胞质和细胞核中均有高量表达。 6.家蚕Bmcop和Bmopsin1基因的原核表达和基因敲除 成功构建pET-28a_Bmcop和pET-28a_Bmopsin1表达质粒，并将两个重组质粒分别导入表达菌株BL21中进行原核诱导表达。经过多次改变诱导条件,SDS-PAGE结果显示在上清和沉淀中均未见与目的条带大小一致的条带，由此可见原核表达不成功，推测与视蛋白含有7跨膜结构域有关。进一步对两个基因进行了基因敲除靶点设计，成功将每个基因设计的三个靶点分别构建到PiggyBic敲除载体上，质粒经纯度检测可使用后将每个基因的3个靶点的混合质粒与辅助质粒A3等体积混合注射。共进行了两次显微注射，但均未能筛选到阳性个体，未能对Bmcop和Bmopsin1功能进行更深入的研究。
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