摘要
甘蓝型油菜具有丰富的食用、油用、饲用、旅游观光等价值。在甘蓝型油菜的生产中，田间杂草危害植株的问题一直存在。杂草的生长导致甘蓝型油菜的养分被争夺，从而生产效率低下。使用选择性除草剂则除草不彻底，而如草甘膦、草丁膦这类除草效果好的除草剂由于没有选择性，也无法在油菜上使用。因此，如果能获得稳定、高产、优质、抗草甘膦的基因工程油菜品系，就能较好地解决我国油菜生产的草害问题。田间种植中，对转入了抗草甘膦CP4-EPSPS基因的甘蓝型油菜其后代的草甘膦抗性进行鉴定。抗草甘膦株系喷施草甘膦除草剂之后，植株并不会枯萎，但是其花器官受到药害非常严重，导致抗草甘膦材料难以和其它材料杂交转育。针对上述甘蓝型油菜抗草甘膦性状转育问题，本研究利用抗草甘膦的转CP4-EPSPS基因油菜SWUWY-35与感草甘膦纯系甘蓝型黄籽油菜L804杂交获得F1代，以F1代自交获得F2代1∶1抗草甘膦、感草甘膦分离群体，研究抗草甘膦CP4-EPSPS基因遗传规律。基于BSA分析法，构建抗草甘膦、感草甘膦子代池，进行全基因组重测序，再利用MutMap+方法定位CP4-EPSPS基因在染色体上的候选区间。在候选区间内利用MISA及IGV软件开发与CP4-EPSPS基因紧密连锁的SSR分子标记及InDel分子标记。为甘蓝型油菜抗草甘膦植株的选育提供方法学基础。主要研究结果如下: 1.草甘膦抗性性状遗传规律观察。 田间种植转CP4-EPSPS基因抗草甘膦植株SWUWY-35,感草甘膦植株西南大学纯系黄籽油菜植株L804,将它们杂交产生F1代群体，F1代自交获得F2代性状分离群体共86株，在苗期取材后喷施草甘膦除草剂并观察记录分离群体表现的草甘膦抗性性状，其中抗草甘膦单株37株，感草甘膦单株49株，卡方检测草甘膦抗性分离比符合期望理论值1∶1（x2＜x20.05），且不受环境影响。初步分析确认草甘膦抗性性状符合单基因控制的遗传模式，属于质量性状。 2.草甘膦抗性基因候选区间的染色体定位。 基于BSA分析法理论，使用抗草甘膦亲本与感草甘膦亲本构建的F2代分离群体，对F2代分离群体提取叶片DNA构建抗草甘膦子代池及感草甘膦子代池，进行深度30×重测序，以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh为参考基因组，对抗草甘膦亲本SWUWY-35、感草甘膦亲本L804和抗草甘膦、感草甘膦子代池重测序及进行数据预处理，用组学分析流程MutMap+,将抗草甘膦基因候选区间锁定在甘蓝型油菜A01染色体19.5～20.5Mb区间内。 3.SSR分子标记开发及验证。 在A01染色体的19.5～20.5Mb候选区间附近使用MISA软件识别微卫星和复合微卫星序列，结合命令行引物设计软件Primer3,快速高效批量设计候选区间附近SSR引物，共设计了50对SSR标记。对标记分别对草甘膦抗性及感性植株DNA进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳以及银染显影后，获得5个SSR标记与草甘膦抗性性状紧密连锁。 4.InDel分子标记开发及验证。 通过1GV软件可视化亲本和抗、感子代池在候选区间内的InDel变异，找到大于5个碱基的插入和缺失位点，使用IGV软件锁定此区间内InDel的起始和终止位置并设计InDel引物，共设计了38对InDel标记。38对标记分别对草甘膦抗性及感性植株DNA进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳以及银染显影后，获得4个InDel标记与草甘膦抗性性状紧密连锁。
NETL