摘要
蜘蛛牵引丝是一种由大壶状腺合成分泌的蛋白质类丝纤维，其具有非凡的机械性能和良好的生物相容性，在生物医学、国防军工、高强度复合材料等领域具有广泛的应用前景。由于蜘蛛丝难以批量收集和生产，人工纺丝技术受到了广泛关注。当前许多研究人员正试图通过生物工程技术在改良的细胞或动物中生产蜘蛛丝，由于对大壶状腺合成牵引丝的生物学过程不清晰，设计的纺丝系统往往过于简化，导致产生的丝纤维与天然蜘蛛丝相差甚远。利用基因组学和多组学手段可以挖掘蜘蛛更完整类型的蛛丝蛋白，并深入理解其优异性能的分子机制成为可能，将有助于优化纺丝系统，大大推动蜘蛛丝规模化应用的发展。本研究以金色圆网蜘蛛棒络新妇（Trichonephilaclavata）为研究对象，探索其大壶状腺分泌牵引丝的生物合成过程。基于三代、二代和Hi-C技术组装出雌蛛高质量的染色体级别基因组，然后利用多组学手段联合解析大壶状腺牵引丝合成过程中涉及到的关键物质与基因，并揭示其形成机制，为进一步开发人工纺丝技术提供有价值的参考信息。主要研究结果如下: 1、棒络新妇蜘蛛基因组组装与进化特征 本研究利用ONT、Illumina和Hi-C结合组装的策略获得了ContigN50为1.78Mb,ScaffoldN50为202.09Mb,BUSCO为96％,基因组大小为2.63Gb,染色体数目为2n=26的棒络新妇雌蛛基因组。基于蛛卵的核型分析显示雌蛛染色体2n=26,雄蛛染色体2n=24,雌蛛比雄蛛多两条性染色体，利用Pool-seq重测序分析识别了Chr12和Chr13为性染色体，并且是尺寸最小的两条。为了注释更完整的基因集，覆盖蜘蛛全身18个组织的转录组和丝腺混合组织的PacBio全长转录组证据被用于基因注释，再结合从头组装和同源证据注释出基因组包含37,607个编码基因。 系统发育分析揭示棒络新妇与星毛络新妇蜘蛛在19.63Mya分化，分化后在Naynayxungla冰期（～0.5-0.78Mya）之前种群有效群体大小达到最大值（6×1e7），随后逐渐衰减。重复序列分析显示棒络新妇基因组重复序列含量为53.94％,其中含量最多的是DNA转座子（22.9％），其次是LTR反转座子（11.41％）。将重复序列扩展到其它七种蛛形纲动物中，结果显示DNA转座子和LTR反转座子在较大蜘蛛基因组中的含量远大于较小蜘蛛基因组。LTR插入时间分析显示在近10Mya内，LTR在较大蜘蛛基因组中连续插入。将DNA转座子和LTR反转座子映射到Hox基因簇间，相似的结果也显示出这两种转座子的高频插入导致蜘蛛的Hox基因组片段增长，以上结果表明了DNA和LTR转座子的扩张应答于蜘蛛基因组增大。 2、棒络新妇蜘蛛的蛛丝蛋白及其进化特征 蛛丝蛋白是蜘蛛丝的核心成分，由于其序列长，重复基序复杂使大量研究者望而却步。本研究基于同源证据比对和手工注释的方式获得了28个高可信度的蛛丝蛋白序列，包括9个MaSp,5个MiSp，4个AgSp,2个FlSp,1个TuSp，1个AcSp,1个PySp和5个其它类型的蛛丝蛋白。这些蛛丝蛋白序列中有26条包含N端、C端和重复序列区，序列长度分布在194aa（MiSp-e）到7819aa（FlSp2）之间。蛛丝蛋白的氨基酸含量分析显示甘氨酸（29.0％）、丙氨酸（18.4％）、丝氨酸（10.3％）、脯氨酸（6.8％）和谷氨酰胺（4.5％）是含量最高的残基。重复基序分析显示β折叠（（GA）n和poly-A）和310螺旋基序（GGX）出现于MaSp和MiSp中，表明MaSp和MiSp的力学性能有更高的强度和延展性。β螺旋基序和O-糖基化位点发生在其余的蛛丝蛋白中，意味着这些蛛丝蛋白具有高的延展性和粘性。其中0-糖基化位点在AgSp和PySp中比例较高，暗示着它们的粘性特征。 系统发育分析、共表达聚类和丝腺形态比较表明Ma、Mi和Fl腺体之间具有更高的相似性，剩余四个丝腺之间有不同程度的相似性或功能相关性。对蛛丝蛋白基因进行染色体定位显示MaSp和MiSp在染色体上聚集的现象，其中MaSp聚集成两个区域MaSp-Group1和MaSp-Group2。MaSp-Group1包括MaSp1a-c和MaSp2e位于Chr4染色体上，MaSp-Group2包括MaSp2a-d位于Chr7上，MiSp-Group包括MiSp-a-e位于Chr6上。同源比对发现MaSp和MiSp也有相似的聚集现象在近缘物种毛络新妇（T.antipodiana）基因组中。通过基因组共线性分析发现物种间的MaSp-Group之间共享更高的共线性，这种共线性远高于物种内MaSp-Group之间的共线性。将每个物种MaSp-Group的氨基酸序列串联进行系统发育分析，结果显示T.clavata和T.antipodian的MaSp-Group1聚成一枝，MaSp-Group2聚成一枝。同义替换率（Ks）分析也表明T.clavata和T.antipodian的MaSp-Group之间的Ks值远小于物种间MaSp-Group之间的Ks值。以上结果表明物种间的MaSp-Group之间亲缘关系更近，MaSp-Group1和MaSp-Group2至少在络新妇属蜘蛛分化前就产生。 3、大壶状腺分泌牵引丝的分子生物学过程 蛋白组分析鉴定出牵引丝中有28个丝蛋白，包括10个蛛丝蛋白（9个MaSp和1个MiSp）和18个非蜘蛛蛋白（1种葡萄糖脱氢、1种粘蛋白（mucin-19）、1种毒液蛋白（Ven）和15种蜘蛛丝元素（SpiCE-DS））。其中MaSp占据了整个丝蛋白丰度的70％含量。代谢组分析识别出牵引丝中有180种代谢物成分，含量最多的三类是有机酸、有机杂环化合物和脂质。追溯牵引丝上的物质在大壶状腺中的来源，分段转录组分析发现有机酸和13种丝蛋白主要来源于Tail,其中编码MaSp-Group1蛋白的转录本是主导成分，Sac是28种牵引丝蛋白和脂质分泌的主要部位，Duct是几丁质、离子（Ca2+和H+）和13种牵引丝蛋白分泌的主要部位。单细胞转录组在大壶状腺中获得了9,349个高质量单细胞，由10种细胞类型组成，其中Sac和Duct特有细胞类型4种，三段组织共享细胞类型1种，Tail和Sac共享1种。拟时序分析揭示大壶状腺由Ma起源细胞首先分化为Tail，然后分化为Duct和Sac特有细胞类型。空间转录组在Ma组织中捕获到了597个spot,聚集成7个簇，拟时序分析显示出Tail向Duct和Sac分化的轨迹。 聚焦于牵引丝28个丝基因在Ma腺体中的单细胞表达和空间位置表达，MaSp-Group1展现出更高更广泛的表达水平，几乎涵盖了大部分的细胞类型，在Tail和Sac部分的细胞类型中表达更高，MaSp-Group2在Sac部分的细胞簇9和10中表达最高。空间转录组显示MaSp-Group1在大部分细胞类型中都表达，尤其是在簇a和b中表达最高，MaSp-Group2主要在簇d高表达。根据牵引丝蛋白组结果显示丝中70％以上的成分都是MaSp蛋白表达，单细胞表达谱进一步证明了MaSp在牵引丝中含量丰富是由于Ma丝腺中存在大量分泌MaSp蛋白的细胞，尤其是表达MaSp-Group1蛋白的细胞最多。Ma三段功能相关基因的表达谱分析揭示有机酸相关GO条目的基因均在Tail部分MaSp-Group1合成细胞和空间区域a中表达较高，这表明有机酸的合成与MaSp分泌密切相关。脂质相关GO条目基因在Sac部分脂质合成细胞和空间区域e中高表达，与MaSp-Group2分泌细胞不重叠，意味着Sac合成MaSp和脂质的细胞来源不同。离子和几丁质相关GO条目基因在Duct部位几丁质合成细胞、pH调节细胞、空间区域f和g中表达较高，表明离子相关基因主要作用在Duct部位。以上结果表明液态丝蛋白溶液在丝腺腔内的分泌与合成是一个精细有序的层级过程。 4、家蚕和蜘蛛的丝及丝腺的趋同特征 家蚕和蜘蛛是节肢动物内亲缘关系相隔很远的两个物种，但是蜘蛛Ma腺（Tail、Sac和Duct）与家蚕丝腺（PSG、MSG和ASG）的形态和结构非常相似，三段结构一一对应。为了表征家蚕和蜘蛛丝腺之间的分子功能相似性，丝腺分段GO功能分析揭示家蚕丝腺和蜘蛛丝腺中部共享脂肪酸代谢过程，前部共享钙离子结合、几丁质结合和信号转导，后部不共享相同GO功能但都是丝蛋白产生的主要部位。在丝腺区段特异表达基因中，筛选到50对表达趋同的直系同源基因，其中家蚕PSG对应蜘蛛Tail有2对直系同源基因，MSG对应Sac有5对直系同源基因，ASG对应Duct有42对直系同源基因。显著的是前部丝腺中有7个Ⅴ型H+转运ATP酶基因，它们被报道是控制丝腺前部成丝的关键因子。蛋白组分析识别到家蚕茧和蜘蛛丝上共享成分mucin-19蛋白和GDH酶，代谢组识别到家蚕茧和蜘蛛丝top90％的代谢物中共享6种代谢物，其中胆碱（Choline）和马来酸（DL-Malicacid）最为丰富，胆碱是细胞膜中磷脂双分子层中的物质，与丝蛋白分泌有关;马来酸可能是丝上的pH控制者，赋予丝的抗腐和抗菌特性。 家蚕和蜘蛛丝及丝腺间存在很多同源物质和趋同表达基因。本研究选择了一个在空间转录组簇f（Duct）中的标记基因Hsp20（Tc04G175120）,该基因编码一种小的热休克蛋白，作为蛋白质伴侣保护其它蛋白质免受错误折叠和聚集。同源比对对应到家蚕Hsp20基因（BMSK0007630），它们之间的蛋白序列高度保守（identity=87.1％），尤其是Hsp20结构域和信号肽区域。通过CRISPR/cas9基因敲除家蚕Hsp20,成功鉴定出Hsp20sgRNA靶位点上的indels（96.46％）。收集敲除成功的家蚕茧进行丝产量统计，结果表明Hsp20-KO个体的产丝量（茧重和茧层率）显著低于野生型，这表明Hsp20与丝产量有关。 综上所述，本研究提供了高质量的棒络新妇蜘蛛基因组和蛛丝蛋白，并且蜘蛛的基因组大小受DNA转座子和LTR反转录转座子的驱动。多组学分析揭示了蜘蛛液体丝原液在丝腺腔内迁移时，依次受有机酸，脂质，pH值和离子梯度剪切力的综合作用，最后经历拉伸力形成不溶性固态丝纤维。家蚕和蜘蛛丝腺之间有趋同的泌丝特征，丝形成过程中都有必不可少的关键过程和组成部分。总之，本研究将为蜘蛛基因组研究和丝纺过程及演化提供重要参考。
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