摘要
目的:牙周炎是发生在牙周组织的慢性感染性疾病，是全球最流行的慢性炎性疾病之一，表现为牙龈软组织和牙槽骨等牙周组织的持续破环，最终导致牙齿缺失。单纯从1990年到2020年，我国牙周炎的发病率就上升了57.3％,而且还在逐年上升。全国第四次口腔健康流行病学调查显示，我国牙周炎的发病率在成年人群中高达86％左右，也就是说10个成年人中近9人患有牙周炎，而调查发现其中接受治疗者却不足20％，我国大多数人没有意识到牙周炎的危害。目前，彻底消除牙周炎的感染和炎症是最终的治疗目标，但要现这个目标还需要探索更有效的治疗方法。因此，研究牙周炎的发病机制和优化治疗方案至关重要。这也是当下口腔医师的重点关注问题。 研究证实外泌体是一种小的分泌细胞器，富含各种有机物(miRNAs和蛋白质)，从细胞释放到细胞外环境中。多种外泌体miRNA在牙周炎中具有独特的特征或功能。牙髓干细胞分泌的外泌体中miR-1246促进牙周组织从促炎表型向抗炎表型的转变。在正畸牙齿移动过程中，人龈沟液中miRNA-29的表达增加，miRNA-29可作为牙周改建的生物标志物。机械应力诱导的外泌体miR-181b-5p促进牙周膜干细胞(Periodontalligamentstemcells,PDLSC)增殖。外泌体miR-200c的增加对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的牙周炎小鼠的促炎细胞因子有抑制作用。此外，外泌体miR-205与许多疾病密切相关。外泌体miR-205-5p是诊断非小细胞肺癌和透明细胞肾癌的生物标志物。来源于卵巢癌细胞的外泌体miR-205促进癌细胞转移。然而，外泌体miR-205如何调控LPS诱导的牙周炎机制尚不明确。 本研究的分析对象是大鼠牙周炎模型，采用临床和动物实验相结合，应用常规实验室检测手段检测证实牙周膜干细胞来源的外泌体miR-205-5p对牙周炎的影响以及外泌体miR-205-5p如何通过靶向XBP1调控大鼠牙周炎模型CD4+T细胞Th17/Tregs的平衡，为今后口腔牙周病临床工作指明新的研究方向。 方法:如下 1.牙周炎进展过程中，外泌体miR-205-5p与Th17/Treg比例变化的探索 1.1提取牙周膜干细胞，从符合纳入排除标准的志愿者处获取健康前磨牙，分离培养出牙周膜干细胞，采用多重梯度分离得到外泌体颗粒，作为后续实验载体。 1.2建立大鼠牙周炎动物模型。30只大鼠随机分为对照组、LPS组和Exo+LPS组，每组10只，常规饲养4w,获取实验研究需要的区域牙龈组织，分离PDLSC,得到CD4+T细胞，分别采用FCM、免疫组化以及qPCR的实验方法检测Th17/Treg相关指标因子的百分率。此研究阶段以期达到观察模型大鼠Th17/Treg的改变趋势并分析外泌体miR-205-5p对牙周炎的炎症反应。 2.牙周炎进展过程中，外泌体miR-205-5p与XBP1的生物学关系分析。 2.14w后采集前一步实验大鼠新鲜血液，分离培养CD4+T细胞，用于下一步实验。 2.2取前一步实验中PDLSCs源性外泌体miR-205-5p用双荧光素酶报告法、RIP法和RNApulldown测定miR-205-5p与X-box结合蛋白1(XBP1)的内在关系,以期明确牙周膜干细胞来源的外泌体miR-205-5p通过XBP1作为载体改变Th17/Treg相关指标因子的百分率影响牙周病的发展。 3.牙周炎进展中外泌体miR-205-5p通过靶向XBP1调节Th17/Treg平衡的机制3.130只实验大鼠随机分为对照组、LPS组和Exo+LPS组三组，每组10只，常规饲养4w,采集新鲜血液标本，分离培养纯化的CD4+T细胞。 3.2将上一步纯化的CD4+T细胞分为对照组，LPS组和Exo+LPS组三组。另外,将对照组分离的CD4+T细胞和PDLSCs也分为对照组、LPS组和Exo+LPS组。每组CD4+T细胞，分别在常规条件，LPS条件，LPS+Exo条件下下进行共培养。各组CD4+IL-17+细胞、CD4+IL-17A细胞、CD4+Treg细胞比例检测应用流式细胞术，各培养基中IL-10、RORγτ以及IL-17A浓度应用ELISA法分析，并采用qPCR法检测细胞内IL-10、Foxp3以及IL-17AmRNA、RORγτ表达水平。并采用westernblot鉴定牙周膜干细胞及外泌体以及其与上述指标的关系。本部分研究拟阐述说明外泌体miR-205-5p通过靶向XBP1调节Th17/Treg平衡的机制。 结果:1.利用WB实验证实从前磨牙中提取出牙周膜干细胞源性外泌体，RT-qPCR实验结果提示LPS组的miR-205-5p表达显著降低(P＜0.01),Exo-miR-205-5p可逆转LPS对炎症细胞数量的促进作用(P＜0.01)，这一趋势与炎症因子mRNA及血清炎症因子蛋白浓度相同(P＜0.01）。 2.通过FCM检测牙周炎大鼠Treg/Th17细胞的百分率结果显示，LPS组高表达Th17细胞，低表达Treg细胞（P＜0.01),而Exo-miR-205-5p却消除了LPS对Th17细胞的促进作用和对Treg细胞的抑制作用(P＜0.01)达到治疗牙周炎大鼠的效果。 3.大鼠牙周炎模型中，XBP1在Exo-miR-205-5p的表达下调（P＜0.01)，在LPS组表达上调（P＜0.05），Exo-miR-205-5p逆转了LPS对XBP1表达增加的影响（P＜0.05），证实XBP1被miR-205-5p下调。 4.LPS诱导的PDSLCs中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达和蛋白浓度通过RT-qPCR和ELISE分析结果证实，XBP1过表达可消除Exo-miR-205-5p对LPS诱导的PDSLCs炎症因子mRNA表达的抑制作用（P＜0.01）对蛋白浓度也表现出相同的趋势（P＜0.01）;Treg/Th17百分比的FCM检测及mRNA表达的RT-qPCR检测，结果证实Exo-miR-205-5p减少了Th17细胞，增加了Treg细胞（P＜0.05），XBP1逆转了Exo-miR-205-5p对LPS诱导的CD4+T细胞中Th17细胞百分比的抑制作用(P＜0.05）和Exo-miR-205-5P对Treg细胞的刺激作用，同时，XBP1可消除miR-205-5p对RORγτ和IL-17A表达的抑制作用及对Foxp3和IL-10表达的促进作用（P＜0.01)。 结论:1.证实外泌体miR-205-5p的表达在LPS诱导的PDLSC衍生的外泌体中减少。 2.Exo-miR-205-5p可通过减少牙周炎大鼠的Th17细胞，增加Treg细胞改善牙周炎大鼠模型的炎症反应和调节Th17/Treg细胞的平衡。 3.miR-205-5p的靶基因是XBP1，并被miR-205-5p下调。 4.Exo-miR-205-5p通过靶向XBP1下调Th17细胞和上调Treg细胞，达到治疗牙周炎大鼠的效果。 因此，牙周膜干细胞来源的外泌体miR-205-5p通过靶向XBP1减轻牙周炎症反应并调节牙周炎中Th17/Treg平衡。本研究为今后牙周炎的治疗提供了新的治疗靶点。
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