摘要
第一部分:小鼠慢性创面愈合过程中巨噬细胞极化类型及影响创面愈合关键的信号通路研究 目的:经由单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）对小鼠创面内巨噬细胞（Mac）极化类型与成纤维细胞（Fib）、上皮细胞（EC）之间的关系，还有影响创面愈合的主要信号途径展开探讨。 方法:经由scRNA-seq法探究小鼠愈合创面（Wound）与未愈合创面（Un_wound）组织在细胞亚群通讯强度、数量与互作方面的不同表现;对2类创面组织中特异性信号途径及其配体-受体加以明确，同时开展比较分析;并探讨小鼠Wound与Unwound组织中Monocyte亚群类型及其几类关键亚群类型。 结果:（1）小鼠2类创面（Wound、Un_wound）的单细胞质控Counts值皆未显示异常，细胞之间表现出较好的整体关联性。Wound组织中的细胞亚群以皮肤组织干细胞（TissueSC）、EC、软骨细胞（Chondrocytes）、B细胞（Bcells）、单核巨噬细胞（Monocyte）、Fib、内皮细胞（Endo）、角化细胞（KC）与T细胞（Tcells）为主;Unwound组织中相关的细胞亚群以皮肤组织SC、T细胞（Tcells）、波纹管细胞（CMP）、Monocyte、神经元细胞（Neurons）、Endo、EC、KC、Fibroblasts、软骨细胞（Chondrocytes）与B细胞（Bcells）为主;在Wound组织中，Monocyte同EC、Fib、Tissuesc细胞亚群之间皆存在紧密联系;在Un_wound组织内，就Monocyte同EC、Fib细胞亚群的通讯强度与数目而言，相较Wound组织皆偏低;（2）对于小鼠慢性创面组织Fib与Epithelial这2类细胞亚群，皆会受到Monocyte所含EGF信号途径CXCL1-Akr1信号轴的活化效应影响，CXCL信号途径内的不同配体-受体之间的作用性，对于整个信号途径，CXCL16-Akr6以及CXCL1-Akr1配体受体所具备的价值最高。对单个配体受体在不同细胞通信中的调控功能进行分析的结果显示，Cxcl3-Ark1配体受体于Mac与血管内皮细胞（VEC）的信号关联性更为显著，且更为关键;（3）Monocyte亚群由0、1、2、3、4、5这五类构成，前两类在Wound组织中占据主要位置，CD68与CD162特异性表达亚群存在比较明显的优势，同时CD163标记的Monocyte数目相较CD68标记的群体数目偏多，Wound组织Monocyte亚群是M1型Mac、M2型Mac，同时占主要位置的是后者。 结论:（1）Wound同组织所含EC、Monocyte、Fib细胞亚群功能存在紧密联系;其中Wound组织内Monocyte细胞亚群同EC、Fib细胞亚群之间的互作强度与数量相较Unwound组织皆明显偏高;（2）M2型Mac的EGF信号途径内CXCL1-Akr1信号轴的活化功能与增强血管新生的分子作用机制在Mac亚群对EC、Fib的调控中起到一定作用;（3）Monocyte细胞亚群所含类型以M1型Mac、M2型Mac为主，后者在Wound组织内主要作用。 第二部分:MEBO湿润烧伤膏活化M2巨噬细胞激活EGF信号通路中CXCL1-Ackr1信号轴促进糖尿病愈合机制研究 目的:分析MEBO湿润烧伤膏对小鼠Un_wound内M2型Mac信号途径EGF内CXCL1-Akr1信号轴的活化效能，还有对于创面上皮化与纤维化的分子促进机制。 方法:实验对象为50只C57BL/6Jnifdc小鼠，经由随机手段，把这些小鼠均等归入至Acute组（急性创面组）、Model组（模型组）、MEBO组（美宝组）、GF组（抑制组）、bixin组（贝复新组）;除了Acute组，对另外4组实验动物实施5d不间断的腹腔内注射STZ干预，用量为50mg/kg，经过8w的连续饲养，采集其尾部静脉血，以证实完成了模型构建。于实验动物背部全层皮肤区域进行缺损创伤模型的构建，Model组、MEBO组与bixin组三组皆向创面上滴加0.02ml生理盐水，GF组实验动物则向创面上滴加0.02ml的CXCL1-Ackr1信号途径抑制剂，同时保证药物全面吸收。分别和DFU模型制备后3d、1w、2w时取动物创面愈合组织。对每组实验动物创面愈合比率加以明确;经由低倍显微镜对5组3d、1w、2w创面愈合状况观察;借助流式细胞仪完成对Mac的分选，经由免疫荧光（IF）染色对Mac中CD163/CXCL1-Ackr1表达量展开分析;经由蛋白印迹法（WB）对5组小鼠3d、1w、2w创面CXCL1-Ackr1、CD163的表达量展开分析。 结果:（1）在时间增加下，5组实验动物的创面组织皆呈慢慢愈合表现，Acute组的愈合状况相较DFU模型组表现出优势;应用CXCL1-Ackr1信号途径抑制剂会使DFU小鼠创面愈合速度下降,MEBO与贝复新的应用则能够使DFU小鼠创面愈合速度提高，其中疗效最佳的是MBEO组。在创面组织中M1（CD68+）荧光强度方面，DFU小鼠相较Acute组偏高，在M2（CD163+）荧光强度上，则相较Acute组偏低;应用CXCL1-Ackr1信号途径抑制剂能够再次提高DFU小鼠创面组织中M1（CD68+）的荧光强度，降低M2（CD163+）荧光强度;MEBO与贝复新的应用能够提高MI（CD68+）荧光强度，降低M2（CD163+）荧光强度;在M1（CD68+）荧光强度上，MEBO组最低，在M2（CD163+）荧光强度上，该组则最高，皆表现出显著不同（P皆＜0.05）。（2）在创面组织中CD163以及CD163/CXCL1-Ackr1的荧光强度方面，DFU小鼠相较Acute组偏低;经由干预使得这两者的荧光强度有所减弱;MEBO与贝复新的应用皆能够使DFU小鼠创面组织中CD163/CXCL1-Ackr1、CD163的强度增强，就这两者的荧光强度而言，最高的是MEBO组，表现出显著区别（P＜0.05）;在创面组织中炎性介质IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6、凋亡指数（AI）水平方面，模型组实验动物相较Acute组皆偏高;应用抑制剂能够使DFU小鼠IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6、AI水平提高;不管是MEBO,还是贝复新，皆能够使IFN-γ、DFUIL-1、TNF-α、IL-6、AI水平下调，尤其是MEBO组实验动物，在IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6、AI水平降幅上最大，表现出明显区别（P＜0.05）;在创面组织中PCNA、COL1A1、CK5、COL11A1表达上，模型组动物相较Acute组偏低;应用CXCL1-Ackr1信号途径抑制剂能够使这4项因子的表达量更低;MEBO与贝复新的应用则都能够使这4项因子的表达量提高，尤其MEBO组的增幅最显著，表现出显著区别（P＜0.05）。 结论:（1）对于小鼠创面而言，高糖环境会导致其迁延愈合;（2）DFU小鼠创面组织中M1/M2紊乱，应用MEBO能够使此问题得到逆转，提高M2型Mac比例，使创面组织炎症活动与细胞凋亡受抑;（3）MEBO经由活化M2型Mac途径将EGF-CXCL-Akr1信号轴的活化信号途径激活，对创面组织血管新生、上皮化与纤维化有着积极影响，由此利于创面尽快愈合。
NETL