摘要
目的:内皮细胞结构和功能的变化是各种心血管疾病的常见病理基础，如高血压，冠心病和主动脉瘤。高血压患者的血管内皮结构和功能严重受损，心脏、脑、肾脏等靶器官损伤与高血压患者血管内皮损伤密切相关。积极探索血管内皮损伤的治疗方法以及机制有重要意义。 阿托伐他汀是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂的一种，是临床上最常用的降低血清胆固醇水平和预防心血管疾病的处方药之一。阿托伐他汀通过降低脂质，抗炎，减少心脏肥大和重塑而在心血管疾病中起有益作用。然而，阿托伐他汀对心血管疾病血管内皮损伤和功能的影响尚不清楚。在这里，我们探索了阿托伐他汀对血管内皮损伤的作用及其机制。 泛素化是调节蛋白质的翻译后修饰（如细胞凋亡，炎症，转录调节和细胞周期）的关键过程。E3连接酶是最关键的因素之一，与多种心血管疾病的发展有关。此前，我们的课题组已经发现WWP2是NEDD4E3泛素连接酶成员，在心脏重塑中发挥保护作用。通过质谱分析，我们发现了WWP2的新型生理底物ATP5A。 ATP5A是线粒体ATP合酶F1复合物亚基α。ATP合酶是线粒体合成ATP最重要的酶，在线粒体内含量及其丰富。传统意义上，ATP5A常作为衡量线粒体功能的指标。近些年发现，ATP5A通过其反向活性，调控钙离子以及构成线粒体通透性转换孔参与细胞的损伤。并且神经系统保护药物J47,正是以ATP5A为靶点发挥作用。本研究探讨了阿托伐他汀对WWP2-ATP5A调控及其在内皮损伤中的作用机制。 方法:1、探讨阿托伐他汀对AngⅡ诱导的高血压血管内皮损伤的作用。我们先将C57BL小鼠分为三组，分别给予NaCl，AngⅡ（2mg/kg/天）和AngⅡ联合阿托伐他汀（15mg/kg/天），一共给药14天。检测小鼠血管壁厚度、纤维化水平、氧化应激水平、凋亡程度和eNOS蛋白表达水平。HUVEC内皮细胞分为三组，分别给予对照，AngⅡ（10nmol/L24h）和AnⅡ（10nmol/L24h）联合阿托伐他汀（1μmol/L24h）刺激。检测eNOS和WWP2蛋白水平。 2、探讨WWP2对ATP5A的相互作用。首先通过质谱分析鉴定出与WWP2相互作用的蛋白ATP5A。使用HUVEC内皮细胞检测WWP2和ATP5A的内源性结合。将HUVEC内皮细胞分为2组，一组外源过表达HA-WWP2，一组作为对照，检测WWP2和ATP5A的结合情况。将HUVEC细胞分为3组:对照组，AngⅡ刺激组，AngⅡ联合阿托伐他汀治疗组，检测WWP2和ATP5A的结合情况。将HUVEC内皮细胞分为4组:分别转染0ug、5ug、10ug、15ug的HA-WWP2,检测ATP5A的表达量。将HUVEC内皮细胞分为2组，一组对照，一组转染siRNAWWP2，检测ATP5A的表达量。 3、探讨WWP2对ATP5A的作用机制。我们将HUVEC内皮细胞分为6组:siRNA-control+CHX（0h）组，siRNA-control+CHX（4h）组，siRNA-control+CHX（8h）组，siRNA-WWP2+CHX（0h）组，siRNA-WWP2+CHX（4h）组，siRNA-WWP2+CHX（8h）组，检测ATP5A水平。我们将HUVEC内皮细胞分为6组:siRNA-control+MG132（0h）组，siRNA-control+MG132（4h）组，siRNA-control+MG132（8h）组，siRNA-WWP2+MG132（0h）组，siRNA-WWP2+MG132（4h）组，siRNA-WWP2+MG132（8h）组，检测ATP5A水平。我们将HUVEC内皮细胞分为2组:对照组、MG132组，检测WWP2和ATP5A的结合情况。我们将HUVEC内皮细胞分为2组:HA-vector组，HA-WWP2组，检测WWP2对ATP5A的泛素化水平。我们将HUVEC内皮细胞分为2组:siRNA-control组，siRNA-WWP2组，检测WWP2对ATP5A的泛素化水平。 4、探讨阿托伐他汀在AngⅡ诱导的损伤中对WWP2-ATP5A的作用机制。我们将HUVEC内皮细胞分为6组:HA-vector组，HA-vector+AngⅡ（10nmol/L24h）组，HA-vector+AngⅡ（10nmol/L24h）+阿托伐他汀（1μmol/L24h）组，HA-WWP2组，HA-WWP2+AngⅡ（10nmol/L24h）组，HA-WWP2+AngⅡ（10nmol/L24h）+阿托伐他汀（1μmol/L24h）组，检测HA,ATP5A,PARP1,cleaved-caspase3，Bax，Bcl-2和eNOS的表达量。我们将HUVEC内皮细胞分6组:siRNA-control组，siRNA-control+AngⅡ组，siRNA-control+AngⅡ+阿托伐他汀组，siRNA-WWP2组，siRNA-WWP2+AngⅡ组，siRNA-WWP2+AngⅡ+阿托伐他汀组，检测HA，ATP5A,PARP1,cleaved-caspase3,Bax,Bcl-2和eNOS的表达量，并检测氧化应激水平和凋亡程度。 5、在小鼠模型中探讨阿托伐他汀改善高血压血管内皮损伤的调控机制。首先我们构建了血管内皮特异性敲除WWP2小鼠:Cdh5Cre-;WWP2FL/FL小鼠和Cdh5Cre+;WWP2FL/FL小鼠。我们将小鼠分为6组:Cdh5Cre-;WWP2FL/FL+NaCl+蒸馏水，Cdh5Cre-;WWP2FL/FL+AngⅡ（2mg/kg/天）+蒸馏水，Cdh5Cre-;WWP2FL/FL+AngⅡ（2mg/kg/天）+阿托伐他汀（15mg/kg/天），Cdh5Cre+;WWP2FL/FL+NaCl+蒸馏水，Cdh5Cre+;WWP2FL/FL+AngⅡ（2mg/kg/天）+蒸馏水，Cdh5Cre+;WWP2FL/FL+AngⅡ+阿托伐他汀（15mg/kg/天）。连续14天药物刺激并测量舒张压和收缩压。在给药后第15天取血管组织，检测Septin4、αSMA、PARP1、Cleaved-caspase3、ATP5A、Bax、Bcl-2和eNOS表达水平。 结果:1、阿托伐他汀治疗后，AngⅡ引起的血管损伤、重塑和功能障碍得到改善，但对AngⅡ刺激造成的血管纤维化没有挽救作用。AngⅡ刺激损伤后，HUVEC细胞WWP2表达量下降，应用阿托伐他汀治疗后，WWP2的表达量得到恢复。 2、WWP2和ATP5A存在相互作用，AngⅡ刺激HUVEC细胞损伤后，WWP2与ATP5A结合能力增强，使用阿托伐他汀治疗后，WWP2和ATP5A的结合能力下降。随着HA-WWP2梯度过表达，ATP5A表达量下降。敲减WWP2后，ATP5A表达量上升。 3、使用CHX刺激后，随着时间的推移，与WWP2-siRNA组相比，control-siRNA组的ATP5A蛋白水平显著降低。MG132在control-siRNA组中应用后，ATP5A蛋白水平随着时间的推移而增加;在WWP2-siRNA组给药MG132后，ATP5A蛋白维持在高水平。WWP2和ATP5A之间的结合在MG132刺激时增强。WWP2过表达后，ATP5A泛素化水平显着升高，并且在WWP2敲低后显着降低。 4、HUVEC内皮细胞损伤后，ATP5A、PARP1和Cleaved-caspase3表达显著升高，eNOS表达水平和Bcl-2/Bax比值显著降低，WWP2过表达显著降低了AngⅡ诱导的ATP5A、PARP1和Cleaved-caspase-3表达的增加，并增加了eNOS表达水平和Bcl-2/Bax比值。与Control-siRNA组相比，WWP2-siRNA组进一步增加了AngⅡ诱导的ATP5A,PARP1和Cleavedcaspase-3表达，并进一步降低了eNOS表达水平和Bcl-2/Bax比值。阿托伐他汀治疗后，上述损伤诱导的蛋白表达变化基本恢复。阿托伐他汀显示出对AngⅡ诱导的血管内皮损伤的保护作用，随着WWP2过表达增强，随着WWP2敲低变得不明显。 5、我们成功构建了血管内皮特异性WWP2敲除小鼠:Cdh5Cre-;WWP2FL/FL小鼠和Cdh5Cre+;WWP2FL/FL小鼠。AngⅡ刺激组小鼠收缩压和舒张压达到高血压水平，AngⅡ和阿托伐他汀联合应用组小鼠血压有一定程度的恢复。AngⅡ刺激后，Septin-4和α-SMA显著升高;与Cdh5Cre-;WWP2FL/FL小鼠的比较，在Cdh5Cre+;WWP2FL/FL中，Septin-4和α-SMA增加得更显著;阿托伐他汀处理后Cdh5Cre-;WWP2FL/FL小鼠中恢复了Septin-4含量，但Cdh5Cre+;WWP2FL/FL小鼠中未恢复;阿托伐他汀处理后，α-SMA含量在Cre-;WWP2FL/FL小鼠和Cdh5Cre+;WWP2FL/FL小鼠中均未恢复。AngⅡ刺激后PARP1和Cleavedcaspase-3显著增加，与Cdh5Cre-;WWP2FL/FL小鼠相比，PARP1和Cleavedcaspase-3在Cdh5Cre+;WWP2FL/FL小鼠中增加更显着;阿托伐他汀治疗后，PARP1和Cleaved-caspase3在Cdh5Cre-;WWP2FL/FL小鼠中恢复，而在Cdh5Cre+;WWP2FL/FL小鼠中没有恢复。AngⅡ刺激后，ATP5A表达增加，eNOS表达水平和Bcl-2/Bax比值降低，与Cdh5Cre-;WWP2FL/FL相比，Cdh5-Cre+;WWP2FL/FL小鼠ATP5A的增加更显著，eNOS表达水平和Bcl-2/Bax的比率降低更显著;阿托伐他汀治疗后，Cdh5Cre-;WWP2FL/FL小鼠的血管组织中ATP5A表达水平、eNOS表达水平和Bcl-2/Bax的比率恢复;而Cdh5-Cre+;WWP2FL/FL小鼠的血管组织中ATP5A表达水平、eNOS表达水平和Bcl-2/Bax比率未得到恢复。 结论:1.阿托伐他汀通过调控WWP2-ATP5A改善高血压血管内皮损伤。 2.阿托伐他汀上调WWP2,促进ATP5A泛素化和降解，稳定线粒体Bcl-2/Bax途径细胞凋亡机制，发挥保护血管内皮细胞作用。
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