摘要
随着免疫受损人群的增加、新冠病毒全球范围内的流行、以及多药耐药真菌的出现，侵袭性真菌感染（Invasivefungalinfections,IFIs）的发病率和死亡率逐年上升。现有抗真菌药物因其种类和数量有限，且具有较大的毒副作用，无法应对当前愈加严重的真菌感染疾病。因此，开发具有新作用机制的抗真菌新药和治疗策略是应对IFIs的有效途径。本论文基于多靶点治疗策略、抗真菌精准治疗策略、真菌自噬诱导策略和羊毛甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）蛋白降解策略开展了一系列抗真菌先导化合物的设计、合成及生物活性研究。主要内容包括: 一、具有真菌HDAC选择性的BRD4-HDAC双靶点抑制剂的设计、合成和生物活性研究 HDAC抑制剂在抗真菌领域多与唑类药物联用发挥抗真菌药效，而BET抑制剂也具有降低真菌毒力的作用。采用药效团融合策略，设计合成一系列BRD4-HDAC双靶点抑制剂，大多数化合物与氟康唑（Fluconazole，FLC）联用时对耐药白色念珠菌显示出良好的协同抗真菌作用。其中化合物B2的协同活性最佳（FICI=0.063），对人源BRD4和HDAC1均具有较好的抑制活性，同时该化合物对真菌总HDACs具有高度选择性（IC50-fungal=2.6nM,IC50-human=4.3μM,SI=1653）,且对HUVEC细胞的毒性（IC50=18μM）低于先导物SAHA和（+）-JQ1。在毒力因子考察实验中发现化合物B2与FLC的联用能够抑制真菌生物被膜和菌丝的形成。进一步的作用机制研究发现化合物B2能够协同FLC下调唑类药物的靶基因（ERG11）、外排泵基因（CDR1、CDR2和MDR1）以及生物被膜相关基因（GCA1和ADH5）的转录，证明该化合物能够通过降低唑类药物的靶标丰度、药物外排以及增加药物摄入等方式逆转真菌耐药。在耐药念珠菌病小鼠模型中，化合物B2能够协同FLC降低小鼠肾脏荷菌量，治疗效果优于同剂量下的单独给药组。因此，具有真菌HDAC选择性的化合物B2是一个具有开发前景的抗真菌先导化合物，其与唑类药物的联合用药是一种高效、低毒的抗真菌治疗策略。 二、光响应型CYP51抑制剂的设计、合成及其对麦角甾醇生物合成通路的光学调控 采用光笼化或光开关化修饰策略，以唑类抗真菌药物为母体结构，成功设计合成一系列具有光笼基团或偶氮苯结构类型的光控型唑类化合物。通过抗真菌活性考察，证实了光笼化修饰策略的有效性，其中以化合物C1的活性屏蔽效果（MIC80-black≥64μg/mL）和光响应抗真菌活性最佳（MIC80-hv=0.5or2μg/mL）。化合物C1在光激活下快速释放FLC并发挥抗真菌作用，其去光笼化过程反应迅速，转化率高达92.3％。化合物C1以光依赖的方式实现对真菌毒力因子（生物被膜和菌丝）的光学控制。在特定的时间和空间对化合物C1进行光激活，证明其光响应抗真菌活性的时空精确性，并通过甾醇含量分析、ERG11下游基因的定量分析和对ERG11杂合突变株活性考察证实化合物C1对真菌麦角甾醇生物合成通路的光控调节作用。化合物C1在非光照条件下无体内抗真菌活性，但经光激活后能够成功延长白色念珠菌感染的大蜡冥幼虫的生存期（Mediansurvival=14days）,并降低小鼠皮肤模型中感染部位的荷菌量，体内治疗效果与FLC相当。本课题利用光响应配体将抗真菌药物的治疗效果与光学控制相结合，发挥光药理学优势，首次针对真菌CYP51实现对真菌麦角甾醇生物合成的光学调节，达到精准治疗的目的。本研究成功验证光控分子调节抗真菌作用的可行性，极大地扩展了光药理学在真菌疾病治疗领域的应用。 三、真菌自噬诱导剂的设计、合成及生物活性研究 真菌自噬的异常会引起细胞内环境稳态失调，导致程序性细胞死亡，这种死亡依赖于自噬蛋白和蛋白酶的表达。通过对一系列自噬相关小分子化合物进行抗真菌活性筛选，得到对新生隐球菌具有选择活性的LRRK2抑制剂GNE-9605（MIC80=8μg/mL）,并以该化合物为母体结构开展结构优化，设计合成一系列氨基嘧啶类衍生物。优选化合物对LRRK2激酶抑制活性表现出不同程度的下降，提示其结合人源靶点所致不良反应的降低。其中，化合物F13显示出优秀的抗新生隐球菌活性（MIC80=0.125μg/mL）和生物被膜抑制能力，并在时间-生长曲线测定中显示出对隐球菌生长的低浓度持续抑制作用。利用自噬探针对真菌自噬过程的实时监测，并对自噬相关基因进行定量分析，证实化合物F13能够成功诱导真菌自噬。在隐球菌性脑膜炎小鼠模型中，化合物F13能够降低小鼠脑部真菌荷菌量，并略微延长小鼠生存期。作为一种具有全新作用机制的抗真菌先导化合物，自噬诱导剂F13具有进一步开发的潜力与价值。 四、基于真菌CYP51蛋白降解的唑类小分子的设计、合成及抗真菌活性考察 合理利用蛋白降解手段是新药开发的一种有效策略。本课题以唑类抗真菌药物艾迪康唑（Iodiconazole）为母体结构，在其侧链引入含有金刚烷基的疏水标签结构，旨在通过配体与CYP51的结合向靶蛋白表面添加疏水基团，模拟蛋白质的部分变性状态，诱导其蛋白酶体降解。对所设计合成的一系列唑类小分子进行体外抗真菌活性测试，结果显示含疏水标签类化合物具有较好抗真菌作用，但仍需继续开展进一步的结构改造，并验证该类化合物的靶向蛋白降解作用。
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